正常白蛋白尿期糖尿病患者血清miR-16-5p与FGF2的相关性及在肾损伤随访中的意义

唐平易， 张 琳， 唐东兴， 刘立亚

微小RNA(microRNA,miR)是一类调节基因表达的非编码小分子RNA。新的证据表明，miR在糖尿病肾脏疾病(diabetic kidney disease,DKD)的发病中起着非常重要的作用[1]。前期研究发现miRNA-16-5p(miR-16-5p)与DKD相关[2-3]，可能调控有关基因参与炎症、肾血管重构和间质纤维化过程，但如何导致和促进糖尿病患者肾损伤的机制目前尚不完全清楚。成纤维细胞生长因子2(fibrolast growth factor 2,FGF2)作为慢性肾脏病重要的致病因子已得到广泛认可，其在糖尿病肾病患者体内表达上调，可导致肾间质纤维化，是DKD重要的损伤因子[4]。miR-16-5p是否通过调控FGF2表达参与DKD的早期肾损害目前未见报道。本研究拟通过对正常白蛋白尿期的2型糖尿病患者进行随访观察，测定其血清miR-16-5p和FGF2水平，并进行相关性分析和生物信息学分析，同时测定肾血管阻力指数等肾损伤指标，探讨miR-16-5p在DKD早期肾损伤中的可能作用机制。

1 对象与方法

1.1对象 本研究以课题组前期研究收集的2016年6-10月衡钢社区体检和南华大学附属第二医院就诊的78例2型糖尿病患者为观察对象。入组标准：符合糖尿病诊断标准确诊为2型糖尿病，病程>10年;入组即时尿标本白蛋白/肌酐比率(urinary albumin creatinine ratio,UACR)<30 mg/g(3次非同日尿标本检测中，2次及以上均<30 mg/g);糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin,HbA1c)水平控制在4%～7%;自愿参加此项调查研究者。排除标准：过去3月内及观测期间有发热及急慢性炎症，有其他急慢性肾病、高血压病，急慢性传染性疾病，严重血液、心、肝、肺、神经系统疾病，器官移植、肿瘤、自身免疫性疾病及合并其他遗传和(或)代谢异常性疾病者。观测期间有剧烈运动、高蛋白饮食及使用对蛋白尿有影响的药物(如血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂等)及不配合随访者。最终至截止观察期24月后，剩余病例60例，男性31例，女性29例，年龄(58.9±9.8)岁(39～72岁)。依据前期研究确定的DKD患者血清miR-16-5p诊断界值为0.665[3]，将病例组分为血清miR-16-5p水平<0.665(A)组和≥0.665(B)组。选取衡钢社区同期体检的78例健康随机个体为对照组(C组)。24月观测期间未有发热、剧烈运动、高蛋白饮食等任何可能影响蛋白尿生成的行为并坚持配合随访。最终至截止观察期C组剩余70例，男性37例，女性33例，年龄(56.1±9.9)岁(32～72岁)。本研究均已获得受测者知情同意。

1.2方法

1.2.1标本留取和检测 所有受试者于清晨空腹留取血标本和尿标本，用于检测空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、HbA1c、血清miR-16-5p、FGF2、尿白蛋白和尿肌酐(留取3次非同日尿标本)，计算UACR(取3次UACR平均值)。随访24月后，留取3次非同日尿标本检测尿白蛋白和尿肌酐，其中两次及以上均>30 mg/g判定为微量白蛋白尿或明显蛋白尿。用于检测miR-16-5p和FGF2的血清标本于-80 ℃冰箱保存，于标本收集结束后统一检测，其余检测均于标本留取当天完成。标本留取、保存及FBG、HbA1c、miR-16-5p、尿白蛋白和尿肌酐检测具体方法均参照课题组前期研究[5]，血清FGF2采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测，试剂盒购自美国R&D Systems公司，酶标仪为Multiskan MK3酶标仪(Thermo公司)，所有操作均严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.2肾脏超声检查 所有研究对象在入组时和随访24月后，于清晨空腹由同一名经验丰富的超声诊断医师完成肾脏B超检测。检查设备为LOGIQ 3 Expert型GE彩色超声诊断仪。具体操作如下：被检查者取侧卧位，首先选择3.5 MHz探头，肾脏模式扫描，初步观察肾脏形态、内部回声，并测量和记录与长轴垂直的肾脏最大横切面积。然后改用彩色多普勒模式观察肾脏血流情况，并记录肾主动脉(master renal artery,MRA)、肾锥体间叶间动脉(interlobar renal artery,IRA)与肾窦部段动脉(segmental renal artery,SRA)的阻力指数(resistance index,RI)。每位被测者左、右肾脏检测重复3次，取平均值为其最终测量数值。

1.2.3生物学数据库分析靶向结合关系 为明确miR-16-5p与FGF2基因表达之间的可能相关性，通过查询miRDB(http://mirdb.org/miRDB/)和TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)两种miRNA靶基因数据库，分别分析miR-16-5p与FGF2基因的可能靶向结合关系。

2 结 果

2.1一般资料及分组情况 对入组时研究对象的一般资料特征进行分析。病例组A和B组分别与对照组(C组)在性别、年龄、血压两两比较，差别无统计学意义。A，B组血清miR-16-5p水平明显低于C组(P<0.01,P<0.05);而FPG,HbA1c,UACR及最大横切面面积、各级血管阻力指数和FGF2均高于C组(P<0.05或P<0.01)。A，B组间FPG，HbA1c，UACR及最大横切面面积和血管(IRA和SRA)阻力指数比较，差别无统计学意义(P>0.05)，但A组miR-16-5p水平明显低于B组(P<0.01)，MRA阻力指数和FGF2水平明显高于C组(P<0.05，P<0.01，表1)。

表1 研究对象一般资料特征

1 mmHg=133.3 Pa. FPG：空腹血糖； HbA1c：糖化血红蛋白； UACR：尿标本白蛋白/肌酐比率； RIMRA：肾主动脉阻力指数；RIIRA：肾锥体间叶间动脉阻力指数； RISRA：肾窦部段动脉阻力指数； FGF2：成纤维细胞生长因子2. A组：血清miR-16-5p水平<0.665； B组：血清miR-16-5p水平≥0.665； C组：对照组. 与C组比较，☆：P<0.01，#：P<0.05； A与B组比较，$：P<0.05，￥：P<0.01.

2.2入组时miR-16-5p与FGF2相关性 对病例(A+B)组入组时血清miR-16-5p表达水平与FGF2水平进行Pearson相关分析，发现二者之间呈显著负相关(r=-0.683，P<0.01)。A，B组FGF2表达水平进行比较，A组FGF2水平明显高于B组(P<0.01，表1)。

2.3生物信息学数据库分析结果 通过miRDB数据库查询发现FGF2基因3′-UTR区存在4个“5′-UGCUGCU-3′”核苷酸片段序列，为miR-16-5p种子序列“5′-AGCAGCA-3′”靶向结合位点，而TargetScan数据库查询同样也发现FGF2基因3′-UTR区存在5个核苷酸片段序列是miR-16-5p种子序列的潜在靶向识别位点，包含了前者4个序列。相同的序列分别位于FGF2基因3′-UTR区1 113～1 119、5 066～5 073、5 599～5 606、5 640～5 647位核苷酸序列区。

2.4随访后尿白蛋白发生情况比较 随访24月后，病例(A+B)组出现微量白蛋白尿或明显蛋白尿的总发生率为35.00%，其中A组18例(43.90%)，而B组3例(15.79%)，两组白蛋白尿转化发生率比较，差别有统计学意义(P<0.05)，而C组转化发生率为0。

2.5不同组肾脏超声指标变化情况 所有研究对象在入组时行肾脏超声探查，肾脏实质回声无明显异常，随访24月后实质回声均无明显异常改变。为进一步了解各研究对象肾脏超声观察指标变化情况，取各观察指标变化(△=随访结束时测量值-入组时测量值)。A，B组肾脏最大横切面积增加均大于C组(P均<0.01)，且A组横切面积增大超过B组(P<0.05)。同样A，B两组各血管阻力指数增加值均大于C组(P均<0.01)，且A组血管阻力指数增加值超过B组(P均<0.05，表2)。

表2随访24月后肾脏超声指标变化情况比较

Tab 2The changes of renal ultrasound indexes were compared after 24 months of follow-up

肾脏超声指标A组B组C组n411970s最大横切/cm25.21±4.60☆#3.25±3.98☆0.22±1.67△RIMRA0.045±0.047☆#0.019±0.0340.011±0.021△RIIRA0.042±0.046☆#0.019±0.0300.010±0.019△RISRA0.043±0.045☆#0.020±0.0300.010±0.019

3 讨 论

DKD是我国终末期肾病的常见原因之一，是糖尿病的慢性并发症，经历了从无明显白蛋白尿向微量白蛋白尿、大量白蛋白尿、终末期肾功能衰竭渐进发展的临床过程。临床上发现，在发展为临床蛋白尿之前，同样存在一个较长的肾损伤阶段。尽管通过控制血糖和血压等治疗，仍不足以完全阻断DKD患者肾损伤病情进展[6]，其机制尚不完全清楚。明确肾损伤的可能机制并开展有效的干预将有利于改善糖尿病患者预后。

研究发现，表达下调的miR-16-5p与DKD患者病情密切相关。低表达的miR-16-5p可通过上调不同的靶基因表达参与炎症、微血管功能障碍和纤维化等过程。通过提高miR-16-5p的表达能减轻糖尿病大鼠肾脏纤维化损伤[7]。本研究发现，处于正常白蛋白尿期的2型糖尿病患者血清miR-16-5p表达明显低于对照组；而临床常用于监测糖尿病病情的指标，如FBG、HbA1c、尿白蛋白、肾脏体积和肾血管阻力指数指标却高于对照组，这提示miR-16-5p的低表达可能与早期DKD病情相关。

肾小球硬化、微血管病变和肾间质纤维化等病理改变是早期DKD肾损伤的有效观察指标。但肾脏病理检查是有创检测，并不适合作为预防疾病的观测指标。本研究选取了UACR和超声肾脏最大横切面积、肾血管阻力指数作为早期肾损伤观察指标。DKD初期患者的临床肾脏超声检查并无明显肾实质回声变化，但随着正常白蛋白尿期向微量白蛋白尿和大量白蛋白尿进展，肾血管阻力指数逐渐增加，肾脏体积可暂时增加。超声肾脏最大横切面积、肾血管阻力指数可作为早期DKD患者检测肾脏损伤的指标。随访24月后，A组有43.90%的患者进展为微量白蛋白尿或明显蛋白尿，发生率明显高于B组(15.79%,P<0.05)，C组却没有出现白蛋白尿转化发生情况。超声检查显示A组肾脏最大横切面积和血管阻力指数24月后较基线值增加明显高于B，C组(P均<0.05)。由此可见，miR-16-5p下调幅度大者更容易出现肾损伤，miR-16-5p水平的下降可能加剧正常白蛋白尿2型糖尿病患者的肾损伤。

本研究通过病例对照研究发现，正常白蛋白尿期的患者血清FGF2表达水平明显高于对照组。同时分析发现,该期患者miR-16-5p表达水平与FGF2表达呈明显负相关，且A组患者FGF2水平明显高于B组。进一步通过生物信息学软件分析证实,miR-16-5p与FGF2编码基因3’-UTR区存在靶向结合关系。FGF2是DKD发生发展的重要影响因子。FGF2高表达与内皮细胞受损有关；FGF2高表达可以引起足细胞足突融合、消失、退缩，甚至从肾小球基底膜分离，导致肾小球滤过屏障受损，对蛋白通透性增加，发生蛋白尿；FGF2高表达还可以作用于肾小管上皮细胞使其表达成纤维细胞特征蛋白，发生上皮-间叶转化(epithelial mesenchymal transitios,EMT)，导致肾间质纤维化[8-9]，引起血管变形；同时可以作用于系膜细胞引起系膜损伤和增生[10]，使毛细血管管腔变小，进而发展为结节性肾小球硬化，从而增加血管阻力。结节性肾小球硬化是DKD的特征性病理改变，微血管病变和间质纤维化是其本质表现。纤维化也可发生在早期DKD[11]。因此，笔者认为，miR-16-5p显著低表达可通过上调FGF2加重早期DKD患者肾损伤，导致其随访后出现尿白蛋白增加和血管阻力指数增加，miR-16-5p/FGF2可能是DKD早期肾损伤重要的调控通路。

总之，本研究选择正常白蛋白尿期的糖尿病患者与健康对照进行研究发现，低表达的miR-16-5p与上调的FGF2密切相关，随访肾损伤发生率更高，miR-16-5p可能通过上调FGF2表达影响早期2型糖尿病患者肾损伤病情进展。本研究由于所选的糖尿病患者受具体病程、治疗方法等因素影响，且为观察性研究，存在一些局限性，下一步仍需通过扩大样本量、增加观察时间和更深入的临床研究和动物实验进一步明确。