lncRNA ANRIL在银屑病患者病变皮肤组织中的表达及其临床意义

金 曌， 陈 慧， 程 杨， 苏 慧， 付 霆

银屑病是一种常见的与免疫相关的慢性炎症皮肤病，欧美人群的发病率约为2%[1-2]。银屑病的病程长，复发率高，不仅影响美观，还会引发多种并发症，如银屑病关节炎、克罗恩病、心血管疾病以及导致患者发病率和死亡率增加的抑郁症等，极大危害患者的身心健康，降低患者的生活质量[3-4]。然而，银屑病迄今尚无可治愈的药物或治疗方法。因此，寻找与银屑病发生、疾病严重程度以及炎症水平相关的生物标志物，对银屑病患者病情的监测以及改善患者预后具有重要意义。长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA)是一类长度>200个核苷酸的不具有编码蛋白质功能的RNA，参与调控多种生物学功能，如胚胎干细胞的分化、肿瘤的发生等生理或病理过程[5-8]。INK4位点的反义非编码RNA(antisense noncoding RNA in the INK4 locus, ANRIL)是一条从染色体9p21.3转录而来的lncRNA，长为3.8 kb。研究发现，lncRNA ANRIL的水平与牙周炎、冠状动脉疾病(coronary artery disease, CAD)和缺血性卒中的发病风险正相关[9-14]，说明lncRNA ANRIL与炎症关系紧密，而银屑病也是一种以高度炎症为特征的皮肤疾病。因此，推测lncRNA ANRIL在银屑病的发病和进展中也有着重要作用。本研究旨在评估lncRNA ANRIL在银屑病患者病变皮肤组织中的表达水平及其与疾病严重程度和炎症因子水平的关联。

1 对象与方法

1.1对象 连续纳入于2016年7月-2018年6月就诊的银屑病患者204例，男性122例，女性82例，年龄(46.4±12.4)岁(19～87岁)，体质量指数(body mass index, BMI)为(23.6±4.10)kg/m2(14.4～33.9 kg/m2)，中位病程、受累体表面积(body surface area, BSA)和银屑病皮损面积及严重度指数(psoriasis area and severity index, PASI)分别为10.0年(5.0～14.8年)，19.0%(16.0%～22.0%)和8.4(6.8～12.1)。正在接受局部治疗、光疗、系统性非生物或生物制剂治疗的患者分别有186，172，140和22例。纳入标准：(1)确诊为银屑病；(2)年龄>18岁；(3)同意钻取皮肤病变组织及附近非病变组织。排除标准：排除伴随除银屑病以外的皮肤炎症疾病，或伴随其他系统性免疫疾病，如类风湿关节炎、红斑狼疮等患者。本研究获医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1收集数据及获取样本 记录患者的年龄、性别、BMI、病程、银屑病受累BSA，并评估PASI评分。记录患者正在使用的药物类型，排除药物对lncRNA ANRIL水平的影响。钻取3 mm深度的病变皮肤组织标本及病变5 cm外的配对正常皮肤组织标本，置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.2定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)检测 采用qPCR检测病变皮肤组织及配对正常皮肤组织的lncRNA ANRIL表达量，并检测病变皮肤组织标本的肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素(interleukin，IL)-6、IL-8、IL-17和IL-22 mRNA表达量。具体操作如下：采用Trizol (美国Invitrogen公司)提取组织总RNA后，采用PrimeScript RT reagent (日本TaKaRa公司)进行RNA的逆转录，然后采用One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit (日本TaKaRa公司)进行qPCR定量检测。以磷酸甘油醛脱氢酶(reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase, GAPDH)作为内参，采用2-△△Ct法计算目标基因的相对表达量。lncRNA和GAPDH引物均根据NONCODE数据库和National Center for Biotechnology Information (NCBI)数据库的基因序列进行设计(表1)。

表1 qPCR引物序列

lncRNA：长链非编码RNA；ANRIL：INK4位点的反义非编码RNA；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL：白细胞介素; GAPDH：磷酸甘油醛脱氢酶.

2 结 果

2.1lncRNA ANRIL表达水平在区分银屑病病变皮肤组织和正常皮肤组织中的作用 qPCR检测结果显示，lncRNA ANRIL在病变皮肤组织[2.135(1.013～3.343)]中的表达量高于配对正常皮肤组织[1.131(0.506～1.833)](P<0.001, 图1A)。lncRNA ANRIL表达水平区分银屑病病变皮肤组织和正常皮肤组织的ROC曲线下面积(area under the curve, AUC)为0.711(95%CI：0.656～0.766)，取最佳切割点lncRNA ANRIL表达量1.966为阈值时(定义为ROC曲线上特异度+敏感度为最大值的点)，其区分银屑病病变皮肤组织和正常皮肤组织的敏感度为54.9%，特异度为78.6%(图1B)。

图1 lncRNA ANRIL在银屑病病变组织和正常皮肤组织中的表达差异Fig 1 The differential expressions of lncRNA ANRIL in psoriatic lesions and normal skin tissues

2.2lncRNA ANRIL表达水平与患者临床特征的关联 病变皮肤组织lncRNA ANRIL表达量与PASI评分正相关(r=0.261，P<0.001)，而与患者的年龄(r=0.080,P=0.257)、BMI(r=0.063,P=0.370)、病程(r=0.017,P=0.814)或受累BSA(r=0.118，P=0.092)无相关性(表2)。此外，病变皮肤组织的lncRNA ANRIL表达量与性别(P=0.118)、局部治疗(P=0.913)、光疗(P=0.252)、系统性非生物制剂治疗(P=0.644)或系统性生物制剂治疗(P=0.625)同样无关(表3)。

表2病变皮肤组织lncRNA ANRIL相对表达量与患者临床特征(连续变量)的关联分析

Tab 2Association between lncRNA ANRIL relative expression in psoriatic lesions and clinical characteristics (continuous variable) of psoriatic patients

临床特征(连续变量)相关系数rP值年龄0.0800.257BMI0.0630.370病程0.0170.814受累BSA0.1180.092PASI评分0.261<0.001

lncRNA：长链非编码RNA；ANRIL：INK4位点的反义非编码RNA；BMI：体质量指数；BSA：体表面积；PASI：银屑病皮损面积及严重度指数.

表3病变皮肤组织lncRNA ANRIL相对表达量和患者临床特征(分类变量)的关联

Tab 3Association of lncRNA ANRIL relative expression in psoriatic lesions with clinical characteristics (classified variable) of psoriatic patients

临床特征(分类变量)lncRNA ANRIL相对表达量性别 女2.304(1.112～3.705) 男1.958(0.954～3.202)局部治疗 无2.019(0.940～3.295) 有2.165(1.022～3.366)光疗 无2.500(1.213～3.983) 有2.117(0.985～3.269)系统性非生物制剂治疗 无2.243(1.205～3.424) 有2.071(0.903～3.295)系统性生物制剂治疗 无2.071(0.982～3.401) 有2.376(1.170～3.223)

lncRNA：长链非编码RNA；ANRIL：INK4位点的反义非编码RNA.

2.3影响PASI评分的因素分析 单元线性回归分析提示，病变皮肤组织lncRNA ANRI表达水平(P=0.001)、年龄(P=0.014)、受累BSA(P<0.001)和局部治疗(P=0.005)均与更高的PASI评分相关；多元线性回归(逐步)分析显示，病变皮肤组织lncRNA ANRIL高表达(P=0.013)、较大的受累BSA(P<0.001)和局部治疗(P=0.008)与患者PASI评分更高独立相关(表4)。

2.4病变皮肤组织lncRNA ANRIL表达量与炎症因子水平的关联 qPCR检测显示，病变皮肤组织中TNF-α，IL-6，IL-8，IL-17和IL-22 mRNA的表达量分别为2.223(1.417～2.985)，1.736(1.086～2.521)，2.529(1.504～3.750)，2.397(1.610～3.417)和2.782(1.642～4.220)。Spearman等级相关检验显示，病变皮肤组织中，lncRNA ANRIL表达量与TNF-α(r=0.248,P<0.001)、IL-6(r=0.219,P=0.002)和IL-17(r=0.252,P<0.001)表达水平正相关，而与IL-8(r=0.065,P=0.355)和IL-22(r=0.097,P=0.069)表达水平无显著相关性(表5)。

3 讨 论

lncRNA ANRIL不仅是调节细胞增殖、分化、凋亡以及介导细胞耐药的重要基因，还是调节炎症反应的重要参与者[15-16]。研究报道，lncRNA ANRIL可通过激活半胱天冬酶结构域家族成员8(caspase recruitment domain family member 8, CARD8)来抑制核因子κB (nuclear factor κB，NF-κB)途径，从而抑制缺血性脑卒中患者的炎症反应[13,17]。另有研究发现，高表达的lncRNA ANRIL可通过与转录因子阴阳1(Yin-Yang 1, YY1)形成功能性复合物，从而促进NF-κB下游炎症基因IL-6和IL-8的表达，进而促进CAD的炎症反应[18]。这些研究提示，lncRNA ANRIL对炎症的调控具有双向性。此外，lncRNA ANRIL在脑卒中组织中高表达，且其高表达与CAD高发病风险相关[13,19-21]。研究也发现，颈动脉硬化斑块lncRNA ANRIL的表达量与颈动脉粥样硬化的严重程度正相关[21]。由此可见，lncRNA ANRIL的表达水平与一些炎性疾病的发生和疾病严重程度相关。鉴于银屑病是一种以皮肤角质形成细胞过度增殖、分化和持续的皮肤炎症为特点的慢性疾病，推测lncRNA ANRIL的表达水平与银屑病的发生和进展相关。笔者评估了银屑病患者病变皮肤组织和配对正常皮肤组织中lncRNA ANRIL的表达量，结果显示，lncRNA ANRIL在银屑病患者的病变皮肤组织中的表达量显著高于正常皮肤组织，ROC曲线结果也显示，lncRNA ANRIL表达量可以较好地区分银屑病病变皮肤组织和正常皮肤组织。此外，关联分析结果显示，lncRNA ANRIL表达量与银屑病的疾病严重程度正相关，进一步的多元线性回归分析表明，病变皮肤组织lncRNA ANRIL高表达与患者更高疾病严重程度独立相关。这些结果可能的原因是：(1)lncRNA ANRIL可能通过多种途径参与银屑病的炎症，如通过调节NF-κB途径增加促炎因子IL-6和IL-8的表达水平，从而促进银屑病的炎症反应，因此其在银屑病的病变皮肤组织中高表达并与更高的疾病严重程度相关[18]。(2)lncRNA ANRIL在银屑病中的作用可能与其在癌症中的作用相似，可以通过促进角质细胞的增殖，抑制角质细胞凋亡，从而导致银屑病角质细胞过度增殖，因此lncRNA ANRIL在银屑病病变组织中高表达，患者表现更高的疾病严重程度[15]。(3)lncRNA ANRIL可能通过介导细胞耐药的方式来促进银屑病的进展[16]。此外，本研究还发现，受累BSA较大和接受局部治疗同样与患者更重的疾病严重程度独立相关，可能是因为受累BSA是PASI评分中的一个标准，因此，受累BSA越大PASI评分越高；至于局部治疗，可能是因为这种治疗方式效果不明显，疾病控制度差，因此PASI评分高。

表4 影响PASI评分的线性回归分析

B：非标准化系数；Beta：标准化系数；PASI：银屑病皮损面积及严重度指数；lncRNA：长链非编码RNA；ANRIL：INK4位点的反义非编码RNA；BMI：体质量指数；BSA：体表面积；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL：白细胞介素.

表5病变皮肤组织lncRNA ANRIL相对表达量和炎症因子mRNA相对表达量的关联

Tab 5Association between lncRNA ANRIL relative expression of psoriatic lesions and relative expression of inflammatory cytokine mRNA

炎症因子mRNA相对表达量相关系数rP值TNF-α0.248<0.001IL-60.2190.002IL-80.0650.355IL-170.252<0.001IL-220.0970.169

lncRNA：长链非编码RNA；ANRIL：INK 4位点的反义非编码RNA；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL：白细胞介素.

为进一步确定lncRNA ANRIL与银屑病炎症的关系，本研究检测了银屑病患者病变皮肤组织中的几个炎症因子mRNA的表达水平，并与lncRNA ANRIL在病变皮肤组织中的表达量做了关联分析，结果显示，银屑病病变皮肤组织中lncRNA ANRIL水平与TNF-α、IL-6和IL-17水平正相关，表明lncRNA ANRIL可能是通过促进患者的炎症来加重患者的疾病严重程度。这可能与其在CAD中的促炎作用相同，lncRNA ANRIL通过调控多种通路，如诱导NF-κB途径激活来促进NF-κB下游的促炎因子TNF-α，IL-6和IL-17的表达[18]。

此外，本研究还存在一些局限性：(1)本研究为单中心研究，可能存在选择偏倚；(2)本研究样本量较小，可能导致统计效能较低；(3)本研究未评估lncRNA ANRIL在银屑病治疗中的作用，这需要在将来研究中进一步探索。

综上所述，lncRNA ANRIL表达水平在银屑病病变皮肤组织中高表达，且与银屑病患者疾病严重程度及炎症因子水平正相关。