羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖修饰的艾塞那肽固体脂质纳米粒的制备及转运能力评价

董晶剑，沈斌，肖艳萍，曹青日，施丽丽,

(1嘉兴学院医学院，浙江嘉兴314001；2苏州大学药学院)

艾塞那肽是第一个人工合成的肠降血糖素类似物，由39个氨基酸组成[1]。艾塞那肽能促使葡萄糖依赖的胰岛素分泌，延缓胃排空，改善胰腺β细胞功能[2,3]，治疗2型糖尿病疗效显著，展现出良好的临床应用前景[4]。作为多肽类药物，艾塞那肽体内稳定性差，半衰期短，口服生物利用度低，目前临床采用皮下注射给药，然而频繁注射造成患者顺应性差，且皮下注射难以达到持续激活胰高血糖素1(GLP-1)受体的作用[5]，疗效不持久。因此，研发长效口服制剂意义重大。由于口服吸收过程存在层层屏障，将艾塞那肽制成普通口服制剂缺乏可行性。将多肽类药物包裹于纳米给药系统内，可增强其在胃肠道内的稳定性，显著促进小肠上皮细胞对多肽类药物的摄取，从而提高口服生物利用度[6,7]。固体脂质纳米粒(SLNs)作为常用的纳米给药系统，具有生物相容性好、保护药物免受胃肠道酶降解、促进药物口服吸收等优势，已成为生命科学领域的研究热点[8]。已有研究表明，固体纳米粒可明显增强胰岛素在胃肠道内的稳定性，提高其口服生物利用度[9,10]。2017年10月～2019年4月，本研究将艾塞那肽包裹于SLNs，以羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖(HACC)进行修饰，通过体外细胞实验对其转运能力进行初步评价。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 超声波细胞粉碎仪(JY96-11N型，宁波新芝生物科技公司)，高分辨透射电镜(TecnaiG220型，美国FEI公司)，激光粒度分析仪(HPP5001型，英国马尔文公司)，超速离心机(OPTIMAL-90K型，美国BECKMAN公司)，跨膜电阻测定仪(Millicell-ERS型，美国密理博公司)。艾塞那肽[批号P141017-3-LP052143，吉尔生化(上海)有限公司]，单硬脂酸甘油酯(化学纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)，大豆磷脂(S100，上海艾韦特医药科技有限公司)，二氯甲烷(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，HACC(南通绿神生物工程有限公司)，聚乙烯醇(Sigma公司)。人结直肠腺癌细胞株Caco-2及人B淋巴细胞瘤细胞株Raji B购自中国科学院上海细胞库。

1.2 纳米粒制备 采用复乳化溶剂挥发法制备纳米粒。内水相：将30 mg艾塞那肽溶于1 mL水中。油相：20 mg大豆磷脂S-100溶于加有2 mL二氯甲烷的西林瓶内，70 ℃水浴下将60 mg单硬脂酸甘油酯盛于西林瓶内，将上述两个西林瓶内油相混合得到均一油相。将水相快速加至油相，200 W超声60 s得到初乳，将初乳迅速转移到20 mL外水相(1% PVA)中，搅拌得复乳，室温持续搅拌5 h去除有机溶剂，得到纳米粒混悬液(Exenatide-SLNs)。在纳米粒混悬液中缓慢滴加0.1% HACC水溶液，使Exenatide-SLNs混悬液与0.1% HACC修饰液体积比为1∶4[11,12]，200 W超声90 s，室温搅拌3 h，得到HACC修饰的艾塞那肽SLNs(HACC-Exenatide-SLNs)。

1.3 纳米粒理化性质及载药量检测 取纳米粒悬液，滴至覆有支持膜的铜网上，于红外灯下烘干，采用高分辨透射电镜观察其形态。取适量纳米粒悬液，以蒸馏水进行稀释，激光粒度仪测其粒径及表面电位。取0.1 mL纳米粒悬液于2 mL EP管内，加入适量甲醇破乳，高速离心取上清，以HPLC法测定上清液中的艾塞那肽，即为W总。取0.1 mL纳米粒悬液，外水相稀释10倍后超速离心45 000 r/min、45 min。以HPLC法测定上清液中游离的艾塞那肽，即为W游离。按公式[13]计算载药量。载药量=(W总-W游离)/W载体×100 %。其中，W总为艾塞那肽总量，W游离为未载入纳米粒的艾塞那肽，W载体为载体质量。

1.4 黏膜滤泡相关上皮(FAE)单层细胞模型建立 按文献方法培养Caco-2、Raji B细胞并建立FAE模型[14]。FAE模型具体制作过程：Caco-2单层细胞培养13 d后，按1×106/mL在Millipore跨膜小室的BL侧(基底侧)加入Raji B细胞，AP侧(肠腔侧)每日更换培养基，BL侧每日半量更换培养基，继续培养至第19天，测定跨膜电阻值(TEER)[15]并检测M细胞特异表达的UEA-1蛋白[16]。Caco-2单层细胞TEER>500 Ω/cm2，加入Raji B细胞后TEER约为Caco-2单层的60%，单层细胞表达UEA-1蛋白，表明已分化出M细胞，FAE模型建立成功。

1.5 药物转运率测算 PBS轻轻洗涤符合转运条件的FAE模型，于37 ℃细胞培养箱中平衡0.5 h，吸走PBS；在供给池分别加入0.5 mL的艾塞那肽溶液(艾塞那肽溶液组)、Exenatide-SLNs混悬液(Exenatide-SLNs组)、HACC-Exenatide-SLNs混悬液(HACC-Exenatide-SLNs组)；在接收池中加入1.5 mL的HBSS溶液，孵育4 h；从供给池取0.1 mL样品，接收池取0.2 mL样品，进行液相分析。按照文献方法计算药物转运率[17]。

1.6 紧密连接蛋白Claudin-1检测 上述“1.5”药物转运实验结束后，去除转运液，FAE单层细胞用预冷的PBS洗涤3次，加入适量裂解液，冰上裂解，12 000 r/min、4 ℃条件离心30 min，取上清，BCA法蛋白定量，用PBS调整各样品浓度，沸水浴进行蛋白变性。随后进行SDS-PAGE凝胶电泳(80 V、1 h，120 V、2 h)，电泳结束后将进行转膜(300 mA，1.5 h)，封闭1 h(5%脱脂奶粉)，TBST洗涤。加入多克隆兔抗Claudin-1于4 ℃过夜，TBST洗涤，加入山羊抗兔IgG，室温下孵育1 h，TBST洗涤，扫描成像。以GAPDH为内参，未进行转运实验的FAE细胞单层作为空白对照(Control)。使用Image J分析蛋白条带灰度值，表示目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 纳米粒形态及理化性质 电镜观察发现，Exenatide-SLNs形态近圆形(图1A)；HACC-Exenatide-SLNs表面变粗糙，有壳聚糖链缠绕(图1B)。HACC-Exenatide-SLNs组粒径低于Exenatide-SLNs组，表面电位由负电位变为正电位，载药量略低于Exenatide-SLNs组(P均<0.05)。见表1。

图1 Exenatide-SLNs、HACC-Exenatide-SLNs电镜下观察形态

纳米粒粒径(nm)表面电位(mV)载药量(%)Exenatide-SLNs226.3±19.8-24.2±2.53.1±0.2HACC-Exenatide-SLNs330.0±16.720.2±1.92.5±0.2

2.2 各组药物转运率 艾塞那肽溶液组、Exenatide-SLNs组、HACC-Exenatide-SLNs组药物转运率分别为0.27%±0.07%、1.35%±0.11%、2.05%±0.08%，Exenatide-SLNs组、HACC-Exenatide-SLNs组药物转运率高于艾塞那肽溶液组，且HACC-Exenatide-SLNs组高于Exenatide-SLNs组(P均<0.01)。

2.3 各组细胞中紧密连接蛋白表达比较 艾塞那肽溶液组、Exenatide-SLNs组、HACC-Exenatide-SLNs组细胞中Claudin-1相对表达量分别为1.100 5±0.088 2、1.001 7±0.153 8、0.628 4±0.043 9，HACC-Exenatide-SLNs组Claudin-1相对表达量低于艾塞那肽溶液组、Exenatide-SLNs组(P均<0.05)。

3 讨论

艾塞那肽是一种蛋白多肽类药物，具有很好的治疗2型糖尿病的前景。如何选择合适、高效的给药途径是蛋白多肽类药物开发过程中至关重要的问题。目前蛋白多肽的给药方式主要是注射给药，然而频繁注射给患者带来诸多不便及痛苦。将蛋白多肽类药物制成口服制剂，可避免注射给药的痛苦。但蛋白多肽类药物分子量大，脂溶性低，物理稳定性差，难以透过肠道细胞膜，且易被胃肠道内酸和消化酶分解，吸收后易受肝脏首过效应，因而将蛋白多肽药物制备成普通口服制剂无法发挥疗效。SLNs具有稳定性高、适用于多种给药途径、具有淋巴吸收可避开首过效应等优势，将蛋白多肽类药物制备成口服SLNs具有广阔的开发前景。

本研究制备了艾塞那肽SLNs，并用HACC对其进行表面修饰。HACC能溶于任意pH值水溶液[18]，由于小分子季铵盐的存在，HACC具有较强的质子化能力、黏膜黏附性能及打开紧密连接的能力。本课题组前期实验从SLNs混悬液与HACC修饰液的比例、超声时间及修饰后搅拌时间三个方面优化了HACC修饰工艺。体积比对粒径有一定影响；超声可降低粒径，可能与超声促使壳聚糖链相互缠绕而紧密包裹于SLNs周围相关；搅拌过程对经HACC修饰的SLNs粒径有微小的影响，壳聚糖长链的缠绕及解聚是一个动态平衡过程。

FAE是体外模拟小肠的一种细胞模型，是将Caco-2细胞与Raji B细胞共孵育，继而分化出M细胞所得。与Caco-2细胞模型相比，FAE模型中M细胞顶端缺乏黏液层，有利于外源物质胞内转运。Shi等[13]将低生物膜透过性药物扎那米韦包裹于以单硬脂酸甘油酯为类脂质的SLNs中，旨在提高其口服生物利用度，但研究结果表明该纳米粒较难通过Caco-2单层膜，认为Caco-2单层膜模拟小肠具有一定局限性。因此,有必要使用FAE模型研究纳米给药系统的吸收作用。本研究采用FAE模型对艾塞那肽纳米粒转运能力进行初步评价。结果显示，将艾塞那肽制备成SLNs可明显促进其跨FAE单层的转运能力，SLNs表面吸附HACC，药物的转运量进一步增加。分析其原因，HACC具有黏膜黏附性能，可延长药物与细胞的接触时间，促进药物跨细胞转运；同时HACC具有打开细胞紧密连接的功能，因此能从细胞旁路途经促进药物的转运。紧密连接是由一系列蛋白组成的复合物，紧密连接的打开有助于促进药物从旁路途径的转运[19,20]。本研究结果显示，HACC-Exenatide-SLNs组Claudin-1相对表达量低于艾塞那肽溶液组、Exenatide-SLNs组，表明HACC修饰的纳米粒可促进细胞旁路途径转运。

SLNs可增加药物跨膜能力，这对艾塞那肽口服制剂的开发具有重要价值。然而，本研究仅从体外对纳米粒的性质、转运能力进行观察，缺乏对其体内应用效果的评价，后续将通过动物模型评价艾塞那肽SLNs的体内降糖效果，为其进一步临床应用提供更多的理论依据。