山西黄芪根际土壤中丛枝菌根真菌的初步分离与鉴定

刘计权，贺润丽，平莉莉，吴金鸿，李庆生

（山西中医药大学，山西晋中030619）

黄芪为豆科药用植物膜荚黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.或蒙古黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao的干燥根［1］。黄芪是一味中医临床极为常用和用量非常大的中药材，也是中成药制药工业使用量非常大的原料药。山西是黄芪的道地产地，2009年浑源县建立国家级黄芪GAP基地，并在国际和国内顶级域名权威机构注册了“恒山正北芪”网络域名。2009年2月，国家中药现代化科技产业（山西）基地建设规划实施方案中将黄芪列为山西省重点发展的9大中药材种植品种之一。2016年6月，“国家中药标准化项目”正式在山西启动，会上确定黄芪为山西省承担的“国家中药标准化项目”中的9大中药品种之一。为满足市场需求，扩大黄芪种植面积，在黄芪栽培中引入新方法、新技术来提升产量和质量是一个需要深入研究的课题。

研究表明，丛枝菌根真菌（arbuscularmycorrhizae fungi，AMF）是陆地生态系统中的关键微生物，能与90%以上的陆地植物形成互惠共生体。该菌能扩大植物根系的吸收面积，参与植物许多生理生化代谢过程，提高植物的光合作用，促进植物根系对矿质元素的吸收，特别是提高植物对氮、磷及微量元素的吸收，减少施肥量［2］。而且能够提高植物对干旱、盐碱、低温、重金属污染等环境胁迫的抗性，减轻土传病虫害的发生，减少农药的施用，同时可提高栽培作物的品质［3］。Morandi D报道，接种菌根真菌可导致药用植物次生代谢产物异常积累，而次生代谢产物是药用植物发挥药效的主要成分［4］。魏改堂等证实AMF可提高荆芥挥发油的含量及曼陀罗中莨菪碱和东莨菪碱的含量［5］。Crush TR发现，AMF能强烈刺激豆科植物的生长和根瘤的形成，接种丛枝菌根真菌可有效改善栽培作物的生长势和品质，特别是有利于提升豆科植物的产量和品质［6］。

本文对山西黄芪根际土壤中的丛枝菌根真菌进行了初步分离和鉴定，以期为今后在黄芪的规范化栽培中应用菌根生物技术提升黄芪的产量和品质提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验仪器 EL204电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）、CHK-213型显微镜（徕卡集团）、YQ-1003A超声波清洗器（上海易净超声波仪器公司）、HH-6数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）、TD5A-WS离心机（常州金坛恒丰仪器制造有限公司）、水浴锅（HH-2-39993）、SZ61奥林巴斯解剖镜（北京瑞科中仪科技有限公司）、20目和 400 目筛子（GB1T6003.1-1997，上海玺瑞五金丝网有限公司）、玻璃仪器等。

1.1.2 实验试剂 酸性品红（南京化学试剂股份有限公司）、氯化钠注射液（国药准字H33021575，杭州民生药业有限公司）、蔗糖、氢氧化钾、乳酸、盐酸、丙三醇（天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯）等。

1.2 实验方法

1.2.1 黄芪根际土壤样品采集 采集地:①黄芪道地产区，山西浑源县千佛岭乡泽青岭村辛庄自然村，海拔1700 m，阴坡，3年生野生蒙古黄芪；②黄芪栽培区，山西中医药大学校园，海拔800 m，阴坡，3年生栽培膜荚黄芪。

采集方法:9月中旬，在黄芪分布区，按1 m间隔随机选取6株黄芪，去掉根际土壤表层腐殖质，以黄芪植株根基为中心，分别在黄芪根际30 cm土壤范围内，按 0～10 cm、10～20 cm、20～30 cm 垂直分层采集土壤，每层取土样1000 mL，将相同层次的土样混匀装入密封袋封口、标记后带回实验室，放入4℃冰箱储存，以免孢子萌发。随后将黄芪根系挖出，剪去枝叶密封标记后，同样放入4℃冰箱储存。

1.2.2 黄芪根际土壤中孢子的分离与鉴定 ①孢子的分离:采用湿筛倾析-蔗糖离心法对黄芪根际土壤中的孢子进行分离［7］。在体视镜下观察分离的孢子，统计每100 mL土样中所有孢子的数量，计算孢子密度。②孢子的鉴定:参照Schenck&Perez丛枝菌根真菌鉴定手册［8］和国内相关文献［9］，采用形态学鉴定法对分离的孢子进行鉴定。

1.2.3 根系侵染率的研究 将采回的根系用自来水缓慢冲洗，洗净根表土壤及杂物，同时注意不能损坏根系表皮。选择直径0～10 mm的根系进行侵染率的研究。根据粗细程度将黄芪根系分为4个等级，一级根 0～2 mm，二级根 2～4 mm，三级根 4～6 mm，四级根6～10 mm。每级根系取样50段。

参照Phillips和 Hayman染色方法［10］对黄芪根样进行染色观察。染色后用显微镜观察每段根的染色情况，通过显微测量统计每个根段的侵染面积。采用四舍五入法，根据侵染面积统计侵染率，侵染面积小于5%，侵染率计为0；侵染面积介于5%～14%，侵染率计为10%；侵染面积介于15%～24%，侵染率计为20%；其余依次类推。不同级别根段侵染率计算公式如下:

侵染率（%）=∑（0×根段数+10%×根段数+20%×根段数+30%×根段数+40%×根段数+50%×根段数+60%×根段数+70%×根段数+80%×根段数+90%×根段数+100%×根段数）/观察总根段数。

2 结果

2.1 不同土层孢子种类与孢子密度

结果见表1。

表1 不同土层孢子种类与孢子密度

由表1可知，在浑源县黄芪野生道地产区，孢子种类和孢子密度统计值在深度10～20 cm土层中最大，0～10 cm和20～30 cm土层均分离出8种孢子，20～30 cm土层的孢子密度最小；在山西中医药大学校园栽培区，10~20 cm土层中的孢子种类和孢子密度统计值同样最大，0~10 cm土层中分离得到4种孢子，20~30 cm土层中分离得到3种孢子。

2.2 丛枝菌根真菌孢子的分离与鉴定

不同产地、不同土层黄芪根际土壤中丛枝菌根真菌孢子的分离鉴定与统计结果见表2。

由表2可知，2个产地黄芪根际土壤中均存在球囊霉属、无梗囊霉属和盾巨孢囊霉属真菌，其中球囊霉属的种类最多，盾巨孢囊霉属的种类最少。浑源县黄芪野生道地产区球囊霉属和无梗囊霉属的种类均多于山西中医药大学校园栽培区。在浑源县黄芪野生道地产区，摩西球囊霉、黑色球囊霉和缩球囊霉在黄芪根际 0～10 cm、10～20 cm、20～30 cm 3个土层均有分布，平均孢子密度相对较大；在山西中医药大学校园栽培区，缩球囊霉分布于0～10 cm、10～20 cm、20～30 cm 3 个土层，摩西球囊霉分布于 0～10 cm、10～20 cm 2 个土层，缩球囊霉和摩西球囊霉的平均孢子密度相对较大。

表2 丛枝菌根真菌孢子的分离与鉴定结果

2.3 不同产地黄芪根系侵染率

不同产地黄芪根系侵染率的实验结果见表3。

表3 根系侵染率的实验结果

表3结果表明，浑源县野生道地产区黄芪根系的平均侵染率为33.4%，显著高于山西中医药大学校园栽培区黄芪根系的平均侵染率。在同一产区，不同粗度的黄芪根段其侵染率也有差异，根段越细侵染率越高，根段越粗侵染率越低。

3 讨论

不同产地、不同土层中黄芪根际的丛枝菌根真菌孢子种类和孢子密度不同，其原因可能是多方面的。不同产地、不同土层的土壤理化性状不同，每一种丛枝菌根真菌对不同理化性状土壤环境的适应性不同；浑源县野生道地产区为蒙古黄芪，山西中医药大学校园栽培区为膜荚黄芪，寄主的不同也是丛枝菌根真菌的种类和密度存在差异性的主要原因。多数丛枝菌根真菌分布在0～20 cm土层范围内，尤以10～20 cm土层范围内丛枝菌根真菌孢子种类最多，孢子密度最大，这是由于丛枝菌根真菌为好气性真菌，在该土层范围内土壤透气性最好，真菌生存环境最好。从丛枝菌根真菌的分布情况也可以看出，浑源县黄芪道地产区土壤的理化性状明显优于山西中医药大学校园栽培区土壤的理化性状。

我国丛枝菌根真菌资源丰富，不同的丛枝菌根真菌与寄主药用植物形成互惠共生体后，对寄主药用植物的生理生化代谢过程可能会产生不同的影响。通过研究，进一步筛选出对黄芪产量和品质形成有益的丛枝菌根真菌，并应用于黄芪的规范化栽培中，是今后仍需要深入开展的研究工作。