罗 清,戴卫波,谢建文,高玉桥,胡 莹
(1.广州中医药大学附属中山中医院,广东中山528400; 2.四会市中医院,广东四会526200)
水翁花为桃金娘科水翁的干燥幼嫩花蕾,《岭南采药录》首次使用水翁花之名,之后大部分文献均袭用此名。其性寒,味苦,归脾、胃经,具有清热解毒,消食滞之功。《广东中药》载:“治外感发热头痛,感冒恶寒发热。”《广西药用植物名录》记载:“治头痛,跌打,蛇伤。”《广西本草选编》载:“治痢疾,肠炎,感冒发热。”[1]广东省民间习惯在夏季作凉茶以解暑。
水翁花主产于广东、海南、广西、福建等省,广东以粤中及中南部市县出产较多。水翁花具有抗炎、解热、镇痛、抑制肠道致病菌、抗诱导癌细胞凋亡、抗炎保肝、降血糖、保护神经细胞活性等药理作用[2-6],已成为降血糖、降血脂开发热点药。关于水翁花抗内毒素的作用未见报道,本课题组前期从抗内毒素休克死亡率方面做过研究,结果发现水翁花能明显提高内毒素血症小鼠生存率[7]。为了进一步研究水翁花抗内毒素的作用机制,本文进一步对水翁花对内毒素致休克小鼠血清中NO和TNF-α含量的影响进行研究。
1.1.1 药品与试剂 水翁花药材(广州康圣药业有限公司提供,产地:广东,批号20170603)。制法:准确称取水翁花1.0 kg,加水煎煮2次,第1次2 h,第2次1 h,过滤,合并2次滤液,静置2 4 h,过滤,滤液浓缩至1000 mL(1 mL相当于原生药1.0 g)。大肠杆菌O55B5内毒素(上海西唐生物科技有限公司);一氧化氮试剂盒(南京建成科技有限公司);小鼠肿瘤坏死因子-α酶联免疫检测试剂盒(南京建成科技有限公司)。
1.1.2 实验动物 SPF级昆明种小鼠60只,体重18~22 g,广东省医学实验动物中心提供,动物生产许可证号:SCXK(粤)2008-0020。实验环境为广州中医药大学附属中山医院屏障级动物实验室,环境温度为18~22℃,相对湿度40%~70%,动物购进后观察1 w。
1.1.3 主要仪器 UV-2550型紫外可见分光光度计,日本岛津公司;BS224S电子天平,北京赛多利斯仪器系统有限公司;Muitiskan MLB3酶标仪,热电(上海)仪器有限公司。
1.2.1 动物分组 取昆明种小鼠60只,雌雄各半。按随机数字表法分为6组,每组10只,正常对照组与模型组灌服等容量生理盐水;地塞米松组注射地塞米松0.02 g/kg;水翁花水提液高剂量组灌服31 g生药/kg,水翁花水提液中剂量组灌服16 g生药/kg,水翁花水提液低剂量组灌服8 g生药/kg。各组均每天灌胃1次,连续给药15 d。
1.2.2 模型建立 于末次给药后1.5 h,除正常对照组腹腔注射等量生理盐水外,其余各组小鼠均腹腔注射大肠杆菌O55B5内毒素60 mg/kg,观察并记录各组小鼠在注射内毒素或生理盐水后3 h内的形态变化和72 h内的生存状况。72 h后将存活小鼠断头取血,3500转/min离心分离血清,于-20℃保存,备检一氧化氮(NO)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。
1.2.3 检测指标 一氧化氮(NO):按照试剂盒说明书,采用硝酸还原酶法测定小鼠血清中NO含量。肿瘤坏死因子(TNF-α):按照试剂盒说明书,采用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定小鼠血清中TNF-α水平。
计数资料采用Stata11.1软件,进行方差分析;计量资料采用SPSS19.0 for Windows软件处理,数据用均数±标准差(±s)表示,采用单因素方差分析,进行Dunnet-t检验。
正常对照组注射生理盐水后,水翁花组、模型组、地塞米松组腹腔注射内毒素1 h内,小鼠均活动自如。12 h后水翁花低剂量组、模型组有部分小鼠死亡,水翁花中、高剂量组死亡较少。除正常对照组外,其余组小鼠均出现烦躁不安、耸毛、颤抖、蜷缩及眼睑充血等现象,其中地塞米松组小鼠症状较轻。注射内毒素后的第3天,水翁花组存活小鼠症状有所好转,而模型组小鼠仍有烦躁不安、颤抖、蜷缩等症状,正常对照组小鼠活动自如。
模型组与正常对照组比较,腹腔注射内毒素所致动物死亡率差异有统计学意义(P<0.01),提示此模型可用于考察水翁花水提液的抗内毒素作用。水翁花水提液高、中剂量组、地塞米松组与模型组比较,腹腔注射内毒素所致动物死亡率差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01),其死亡率分别为10%、20%、0%。结果见表1。
表1 水翁花水提液对内毒素休克小鼠死亡率的影响
与正常对照组比较,模型组小鼠血清NO、TNF-α 含量差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,水翁花水提物中、高剂量组小鼠血清NO、TNF-α 含量下降,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。结果见表 2。
表2 水翁花水提液对内毒素休克小鼠血清中NO、TNF-α含量的影响
内毒素(ET)又称为“热源”,是革兰氏阴性细菌细胞壁外膜上的一种脂多糖(LPS)与微量蛋白质的复合物,其中LPS是内毒素活性成分,可引起发热、微循环障碍、内毒素休克等多种疾病。本课题组前期已从抗内毒素休克死亡率方面做过研究,发现水翁花能明显提高内毒素血症小鼠的生存率。为进一步探讨抗内毒休克死亡的机制,本文研究了水翁花对内毒素致休克小鼠血清NO和TNF-α含量的影响。结果显示水翁花水提液高、中剂量组小鼠血清中NO和TNF-α含量比模型组下降,且动物死亡数明显减少,表明水翁花具有良好的抗内毒素休克死亡的作用。但具体是哪种活性成分发挥抗内毒素作用还有待后期进一步研究。