海人酸促进小胶质细胞增殖的P38MAPK/AP-1信号通路的研究

王娜　佟凤芝　曾常茜

【摘 要】目的：观察海人酸活化BV-2小胶质细胞的增殖，通过P38MAPK/AP-1信号通路探讨海人酸活化BV-2小胶质细胞增殖的相关分子机制。方法：BV-2细胞随机分为对照组、海人酸组，用倒置显微镜观察各组BV-2细胞数量及形态;用免疫组化法检测各组BV-2细胞c-Jun、c-Fos和P38蛋白的表达。结果：倒置显微镜结果显示，海人酸组与对照组相比，BV-2细胞数量增加，胞体变大变圆，突起变短或消失;免疫组化结果显示，对照组BV-2细胞c-Jun蛋白表达阳性率为0.041±0.003;海人酸组BV-2细胞c-Jun蛋白表达阳性率为0.805±0.029，较对照组显著增加（P<0.05）;对照组BV-2细胞c-Fos蛋白表达阳性率为0.039±0.003;海人酸组BV-2细胞c-Fos蛋白表达阳性率为0.784±0.028，较对照组显著增加（P<0.05）;对照组BV-2细胞p38蛋白表达阳性率为0.216±0.013;海人酸组BV-2细胞p38蛋白表达阳性率为0.438±0.014，较对照组显著增加（P<0.05）。结论：海人酸活化的BV-2细胞增殖，其分子机制可能与上调P38MAPK/AP-1信号通蛋白表达有关。

【关键词】BV-2小胶质细胞;增殖;P38MAPK;AP-1

【中图分类号】R282【文献标识码】A【文章编号】1005-0019（2019）22--01

癫痫是大脑神经元异样放电诱发的脑功能障碍疾病[1]。癫痫的病因之一是小胶质细胞的数量及形态异常，导致细胞残骸积累和炎症反应增加[2]。所以，深入研究小胶质细胞增殖价值是防治癫痫的关键环节。本实验检测海人酸活化小胶质细胞P38MAPK、AP-1蛋白表达，旨在揭示海人酸活化小胶质细胞的分子机制。

1 材料

BV-2小胶质细胞株由中国医科大学提供。兔抗小鼠p38蛋白抗体、兔抗小鼠c-Jun抗体、羊抗兔HRP-IgG抗体、小鼠抗小鼠c-Fos抗体、兔抗小鼠HRP-IgG抗體、DMEM培养基、胎牛血清、海人酸、DAB 显色剂均购自试剂公司。

2 方法

2.1 细胞的实验分组

将BV-2细胞随机分为对照组、海人酸组。

2.2 倒置显微镜观察BV-2细胞增殖

BV-2细胞5% CO2培养箱培养24h，分为二组，观察小胶质细胞数量及形态。

2.3 免疫组化法检测BV-2细胞c-Jun，c-Fos和P38蛋白表达

将处于对数生长期的BV-2细胞分为三组，PBS清洗后，多聚甲醛处理，曲拉通固定，H2O2孵育，羊血清封闭。再加入兔抗小鼠c-Jun 抗体、兔抗小鼠p38蛋白抗体、小鼠抗小鼠c-Fos抗体，4 ℃冰箱中过夜，次日PBS冲洗后加入羊抗兔HRP-IgG抗体、兔抗小鼠HRP-IgG抗体，PBS冲洗。DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片，镜下观察。

2.4 统计分析

实验数据采用SPSS17.0统计软件，计量资料以（）表示，组间比较用单因素方差分析。P<0.05为差异具有显著性。

3 结果

3.1 海人酸活化BV-2细胞的增殖

结果见图1。倒置显微镜下可见对照组（图A）BV-2细胞贴壁，形态规则，体积瘦小，突起细而长。海人酸组（图B）与对照组相比，BV-2细胞数量较多，且生长密集成团，细胞体积变大变圆，突起变短或消失。

3.2 海人酸活化BV-2细胞c-Jun蛋白、c-Fos蛋白及p38蛋白的表达

结果见表1。对照组BV-2细胞c-Jun蛋白表达阳性率为0.041±0.003，c-Fos蛋白表达阳性率为0.039±0.003，p38蛋白表达阳性率为0.216±0.013;海人酸组BV-2细胞c-Jun蛋白表达阳性率为0.805±0.029，c-Fos蛋白表达阳性率为0.784±0.028，p38蛋白表达阳性率为0.438±0.014，结果均高于对照组（P<0.05）。

4 讨论

4.1 海人酸活化小胶质细胞的增殖

Benson MJ等[3]用海人酸建立小鼠癫痫模型，用流式细胞术检测到小鼠海马M1小胶质细胞数量明显增多。本实验用海人酸体外作用BV-2细胞，发现海人酸组与对照组比较胞体增大，突起减少甚至不见，细胞分布密集，数量明显增多，表明海人酸可以促进BV-2细胞增殖。

4.2 海人酸活化小胶质细胞p38蛋白的表达

p38是丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）家族中重要的亚家族，参与转录调控、细胞增殖、凋亡等病理过程。Hwang CJ等[4]研究发现ERα基因缺陷小鼠小胶质细胞活性增加，表明小胶质细胞参与神经损伤性疾病可能与p38蛋白高表达有关。本实验免疫组化测定细胞p38蛋白阳性率显著增高，表明p38蛋白可能参与了小胶质细胞活化。

4.3 海人酸活化小胶质细胞AP-1蛋白的表达

AP-1由c-Fos和c-Jun形成的同源或异源二聚体构成，作用于基因转录调控，参与细胞的分裂增殖[5]。Meade AJ等[6]用海人酸处理小胶质细胞，模拟癫痫发病模型，发现小胶质细胞死亡数量明显下降。本实验通过海人酸体外刺激小胶质细胞，结果发现免疫组化测定细胞c-Jun和c-Fos蛋白阳性率显著增高，表明AP-1蛋白可能参与了癫痫小胶质细胞活化。

综上，海人酸促进BV-2细胞增殖可能与上调P38MAPK/AP-1信号通蛋白表达有关，此为进一步揭示小胶质细胞增殖的分子机制提供了实验依据。有关海人酸活化小胶质细胞对其他信号通路的作用机制尚不清楚，有待进一步深入研究。

参考文献

Ngugi AK， Bottomley C， Fegan G，et al.Premature mortality in active convulsive epilepsy in rural Kenya： Causes and associated factors[J].Neurology， 2014， 82（7）： 582-589.

Diazaparicio I， Beccari S， Abiega O， et al.Clearing the corpses： regulatory mechanisms， novel tools， and therapeutic potential of harnessing microglial phagocytosis in the diseased brain[J].Neural Regeneration Research， 2016， 11（10）：1533-1539.

Benson MJ， Manzanero S， Borges K.Complex alterations in microglial M1/M2 markers during the development of epilepsy in two mouse models[J].Epilepsia， 2015， 12（9）： 21-60.

Hwang CJ， Choi DY， Jung YY， et al.Inhibition of p38 pathway-dependent MPTP-induced dopaminergic neurodegeneration in estrogen receptor alpha knockout mice[J].Horm Behav.2016，80：19-29.

Wagner E F.AP-1-Introductory remarks.[J].Oncogene， 2001， 20（19）：2334-2335.

Meade A J， Meloni B P， Mastaglia F L， et al.AP-1 inhibitory peptides attenuate in vitro cortical neuronal cell death induced by kainic acid.[J].Brain Research， 2010， 1360（1）：8-16.