枯草芽胞杆菌发酵液对苹果树腐烂病的防治效果

翟世玉 殷辉 周建波

摘要 为明确来自苹果树上的1株生防菌LF17对腐烂病菌的抑制作用及其发酵液对腐烂病的防治效果，采用形态学结合16S rDNA和gyrA基因序列分析对菌株LF17进行了鉴定，并通过滤纸法测定了发酵液对腐烂病菌的抑制率，利用涂抹发酵液的方法测定了发酵液对腐烂病的防效。结果表明，菌株LF17发酵液对腐烂病菌的抑菌率为93.80%，与甲基硫菌灵（94.20%）抑菌率相当，显著高于嘧菌酯（42.60%）、辛菌胺（52.80%）和苯醚甲环唑（81.30%）;离体枝条防治结果表明，发酵液水剂和膏剂对腐烂病的防效为78.59%～80.40%，与甲基硫菌灵（76.93%）相比差异不显著，与嘧菌酯（44.15%）、辛菌胺（68.25%）、苯醚甲环唑（74.45%）相比差异显著;田间试验表明，涂有发酵液的伤口愈合面积为9.37～9.79 cm2，病疤复发率为3.82%～4.56%，与其他4种药剂相比差异显著。研究表明菌株LF17发酵液对腐烂病菌有明显抑制作用，且可促进伤口的愈合并显著降低腐烂病的复发。

关键词 苹果树腐烂病; 枯草芽胞杆菌; 发酵液; 抑菌率; 防治效果

中图分类号： S 436.611.1  文献标识码： A  DOI： 10.16688/j.zwbh.2018376

Abstract The objective is to define the inhibitory effect of a strain LF17 isolated from apple trees and the control efficacy of the fermentation broth against the apple Valsa canker. Based on the morphological characteristics， 16S rDNA and gyrA sequence analysis， the strain LF17 was defined as Bacillus subtilis. The inhibition rate and control efficacy of fermentation broth on V.mali was tested by filter paper method and daubing fermentation broth， respectively. The results showed that the inhibition rate of fermentation broth against V. mali was 93.80%， which was similar to that of thiophanate-methyl （94.20%）， but significantly higher than those of azoxystrobin （42.60%）， xinjunan （52.80%） and difenoconazole （81.30%）. Control efficacy test on excised twigs showed that the inhibition rate of fermentation broth against apple Valsa canker was 78.59%-80.4%，which was no obvious difference with that of thiophanate-methyl （76.93%）， but significantly different from those of azoxystrobin （44.15%）， xinjunan （68.25%） and difenoconazole （74.45%）. Field experiment showed that the healing area of fermentation broth was 9.37-9.79 cm2， and the recurrence rate of apple Valsa canker was 3.82%-4.56%， which was significantly higher than chemicals. The results indicated that the fermentation broth of LF17 had a significant inhibitory effect on V. mali. It can effectively stimulate the wound healing and remarkably reduce the recurrence of apple Valsa canker.

Key words apple Valsa canker; Bacillus subtilis; fermentation broth; inhibition rate; control efficacy

蘋果树腐烂病（apple Valsa canker）是对我国苹果危害范围非常广的毁灭性病害之一，该病由黑腐皮壳属Valsa spp.真菌引起，导致苹果枝干发病，严重制约着苹果产业的发展[1-2]。在很长一段时间内，生产上主要依靠化学药剂防治苹果树腐烂病，致使果园生态环境恶化，且出现腐烂病菌的抗药性菌株[3-4]。现阶段生物防治苹果树腐烂病是国内外学者研究的焦点。

郜佐鹏等[5]、邓振山等[6]、徐涛等[7]、蔡光华等[8]和王彩霞等[9]从土壤、苹果树及其他植物中筛选出的放线菌、真菌、细菌PG-10-8-11v、微嗜酸寡氧单胞菌等对苹果树腐烂病菌有较好的抑制作用。在苹果树腐烂病菌的拮抗菌中，芽胞杆菌是被筛选鉴定较多的类群[10-12];其中短小芽胞杆菌Bacillus pumilus[13]、解淀粉芽胞杆菌B.amyloliquefaciens[14]、枯草芽胞杆菌B.subtilis[15]对腐烂病菌都有较好的抑制作用。目前，国内外研究者主要侧重芽胞杆菌的筛选鉴定和其对腐烂病菌的抑菌作用[16-17]。关于枯草芽胞杆菌防治腐烂病的田间研究较少。2015年，Zhang等通过田间试验发现解淀粉芽胞杆菌对腐烂病有较好的防控效果[14]。

生产中有少量商品化的芽胞杆菌生物制剂用于防治腐烂病[18]。较为成功的产品是以枯草芽胞杆菌（Bs-0728）为主要菌群研发的菌肥木美土里，根施该菌肥可提高苹果树的抗病性、显著降低腐烂病的发病率;使用菌泥治疗腐烂病，其对伤口愈合有良好的促进作用[19]。枯草芽胞杆菌已经显示出作为腐烂病生防菌的巨大潜力[20-23]。本研究对菌株LF17进行了鉴定，并进行了其对苹果腐烂病菌抑制率测定及对苹果枝条腐烂病的防治效果试验，以期探索该生防菌株对腐烂病的防控效果以及对伤口愈伤组织形成的作用，为腐烂病的生物防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株：本研究选取对腐烂病菌抑制效果较好的代表性菌株LF17进行系统研究，菌株从山西省苹果产区临汾市苹果园的树枝干上分离获得;苹果树腐烂病菌Valsa mali 菌株编号YC90，由山西省农业科学院植物保护研究所植物病害研究室保存。

本研究供试培养基、化学药剂及发酵液见表1。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌的分离及鉴定

采用划线法分离菌株，28℃培养20 h挑取单菌落。纯化后的菌株28℃培养3 d，记录菌落形态，4℃保存备用。参考王卫雄等利用16S rDNA[15]和gyrA序列结合菌株的形态特征进行鉴定。

1.2.2 芽胞染色

挑取单菌落，涂片经火焰固定后滴加5%孔雀绿水溶液加热30～60 s使其产生蒸汽4次，水洗至无色，0.5%番红水溶液复染2 min，水洗至无色，待载玻片晾干后油镜镜检[27]。

1.2.3 发酵液和4种化学药剂对腐烂病菌的抑制作用

采用对峙法[28]筛选获得1株拮抗菌LF17，活化LF17后接种于NB培养基，150 r/min、28℃培养3 d获得发酵液，4℃保存备用。采用滤纸法[29]测定发酵液原液的抑菌率，将直径为1.00 cm无菌滤纸片放入发酵液和无菌水中浸泡2 h后取出，置于无菌超净工作台吹干。在PDA培养基平板中间接种直径为0.50 cm的腐烂病菌菌饼，再将浸泡过发酵液的滤纸片放到平板边缘距中心2.50 cm处，每皿对称放4片，重复3次，无菌水处理为对照，于28℃培养，待对照平板长满菌丝后测量菌落直径，计算抑菌率。对峙培养的培养皿中距离腐烂病菌菌饼0.50 cm处插入盖玻片，培养7 d后观察腐烂病菌菌落、菌丝等的变化。

采用菌丝生长速率法测定4种化学药剂对腐烂病菌菌丝生长的影响，含药培养基制备参考周建波等[30]的方法。置于28℃下培养，以只接种腐烂病病原菌的平板为对照，每处理3次重复。待对照平板上长满菌丝后测量菌落直径。抑菌率计算方法参考邓振山等[6]。

抑菌率=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）对照组菌落直径×100%。

1.2.4 LF17发酵液和化学药剂对离体枝条抑菌活性测定

将原发酵液加入吐温80制成水剂，吐温80的含量为溶液质量的2%，装瓶备用;将原发酵液每100 mL加入9 g黄原胶，制成黄原胶含量为0.6%的膏剂，装瓶备用。水剂和膏剂中的芽胞含量为108 cfu/mL。

参考臧睿等[31]的烫伤接种法，选取2年生背上枝，截成120 cm作为接种材料，端口封蜡、自来水冲洗2次后，用75%乙醇表面消毒，无菌水冲洗3次。用铁钉冒（直径为0.50 cm）烫伤树皮，每个枝条5个烫伤口、相距20.00 cm，4个伤口接腐烂病菌，1个为对照;每个处理接种3个枝条。在接种部位上方1～2 cm处加一块无菌水浸湿的脱脂棉，用塑料薄膜将其和接种体包扎好。接种后将枝条扦插于含水量约40%的无菌细沙中，在温度25℃、相对湿度约40%条件下培养。

待伤口扩展后，挑选病斑扩展长度为（1.00±0.30）cm的枝条进行离体枝条腐烂病菌抑菌试验。用小刀在病斑处刻线，深至木质部。纵横交错，距离约0.50 cm。将伤口刻好线后，用毛笔在烫伤部位涂抹发酵液、发酵液膏剂、发酵液水劑及4种化学药剂（厂家推荐剂量），NB培养基作为对照。处理后的枝条插入含水量约40%的无菌细沙中，于25℃保湿培养10 d，观察记录枝条的发病情况，测量病斑长度，计算防治效果、试验重复3次。

防治效果=

（对照组病斑长度-处理组病斑长度）对照组病斑长度×100%。

1.2.5 LF17发酵液和化学药剂对苹果腐烂病的田间防效试验  2016年的3月进行田间防治试验。首先对病组织进行刮治，刮治时彻底刮除病组织、深至木质部，四周外延0.50 cm，尽量使刮治伤口纵长、横窄，切面光滑。刮除病组织后，分别涂抹上述配制好的发酵液、发酵液膏剂、发酵液水剂及4种化学药剂（厂家推荐剂量）使其完全覆盖刮治后的伤口并外延1.50 cm，处理后每隔10 d再涂1次，共3次。以NB培养基作为对照，每个处理20个病疤，3个月后测量伤口愈合面积，次年3月调查病疤复发情况。愈合面积采用坐标纸法[32]，用一张纸在伤口总面积部位外围和内部未愈合部位外围画外围线，然后把两个周线描绘在单个方格为1 cm2的坐标纸上，计算愈合面积。病疤复发率计算参考曹欣然等[33]，公式如下。

病疤复发率=病疤累计复发病块数调查病疤总块数×100%。

1.3 数据处理

采用Excel 2003进行图表数据处理，并采用SPSS 17.0软件进行差异显著性分析（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌鉴定

2.1.1 拮抗菌形态学特征

菌株LF17在28℃下培养3 d 可出现明显菌落，其形状不规则、初期白色，后期为黄褐色、中央略突起、不透明、表面粗糙，产芽胞，镜检芽胞呈椭圆形或杆状（图1）。

2.1.2 基于16S rDNA和gyrA基因序列系统发育分析

利用16S rDNA序列，以B.licheniformis为外类群构建系统发育树。分离菌株LF17和B.subtilis（JQ 361067、KF496886、GU722647等）以98%自展支持率聚为同一个分支（图2），表明其与B.subtilis的亲缘关系较近。

利用gyrA基因序列，以B.licheniformis为外类群构建系统发育树。分离菌株LF17和B.subtilis（JX 977128、JX 977131、JX 977130等）以100%自展支持率聚为同一个分支（图3），表明其与B.subtilis的亲缘关系较近。结合形态学特征、16S rDNA和 gyrA 基因序列分析结果，将菌株LF17鉴定为B.subtilis。

2.2 发酵液与4种化学药剂的抑菌效果及对腐烂病菌菌丝形态的影响  供试4种化学药剂对腐烂病菌（菌株YC90）的抑菌率范围为42.60%～94.20%，其中苯醚甲环唑和甲基硫菌灵的抑菌率较高，分别为81.30%和94.20%、二者差异显著;嘧菌酯和辛菌胺抑菌率较低，二者差异显著;菌株LF17发酵液的抑菌率为93.80%，和甲基硫菌灵对腐烂病菌的抑菌率相当、二者差异不显著，发酵液与嘧菌酯、辛菌胺、苯醚甲环唑3种药剂相比差异显著（图4）。

腐烂病菌与菌株LF17对峙培养7 d后，相比对照腐烂病菌落呈深褐色;菌丝为褐色、顶端膨大、粗细不均匀、分支增多，部分菌丝细胞质外渗（图5）。

2.3 LF17发酵液和化学药剂对离体枝条的防治效果

供试4种化学药剂对腐烂病防治效果为44.15%～76.93%、病疤平均长度范围为2.23～5.40 cm，其中苯醚甲环唑和甲基硫菌灵对腐烂病的防效较好，分别为74.45%和76.93%、二者差异不显著;嘧菌酯和辛菌胺防效较低，二者差异显著。

发酵液和辛菌胺对腐烂病病疤的防效分别为71.76%和68.25%，二者差异显著;发酵液膏剂、水剂对腐烂病的防治效果最好，分别为78.59%和80.04%，二者差异不显著，与甲基硫菌灵相比差异不显著，与其他3种药剂相比差异均显著，病疤平均长度分别为2.07 cm和1.93 cm，二者差异不显著，与甲基硫菌灵相比差异不显著，与其他3种药剂相比差异均显著（图6）。

2.4 LF17发酵液和化学药剂对苹果腐烂病的田间防治效果  使用4种化学药剂后腐烂病复发率为8.83%～27.92%、病疤愈合面积为4.96～6.63 cm2，其中甲基硫菌灵防治腐烂病后复发率为8.83%，显著低于其他3种药剂处理的复发率;嘧菌酯和辛菌胺复发率较高，分别为27.92%和21.31%，二者差异显著。

发酵液、发酵液膏剂、发酵液水剂防治腐烂病后复发率较低，均在4.50%以下，显著低于4种化学药剂的复发率;涂抹发酵液的伤口愈合面积均在9.00 cm2以上，其中涂抹发酵液膏剂的伤口愈合效果最好，达到9.79 cm2，发酵液和发酵液水剂处理的伤口愈合面积分别为9.23 cm2和9.37 cm2，二者差异不显著（图7～8）。

3 结论与讨论

枯草芽胞杆菌天然存在于自然界，其中很多菌株具有防病及促生作用，被广泛地开发应用[34]。本试验筛选、鉴定来自苹果树皮上1株对腐烂病菌抑菌率高的枯草芽胞杆菌，经离体枝条和田间试验表明其发酵液可有效防治苹果树腐烂病。拮抗细菌对真菌的主要作用是抑制分生孢子的萌发和菌丝生长[35-36]，这也与本研究结果一致。菌株LF17发酵液显著抑制腐烂病菌菌丝生长，效果较好，可有效防治腐烂病，具有生防应用意义。

生产中主要采用刮治并涂抹化学药剂防治苹果树腐烂病。本研究供试的4种化学药剂在室内均表现出较高的抑菌活性，然而田间试验发现刮治并涂抹化学药剂后伤口愈合能力差，长期裸露易滋生病菌，病疤复发率高。

本试验使用刮治并涂抹生防菌发酵液防治苹果树腐烂病，表明可促进伤口的愈合并显著降低腐烂病的复发。枯草芽胞桿菌发酵液中含有能促进伤口愈合的物质，伤口部位被愈伤组织完全封闭，能有效阻止腐烂病的复发[36]。通过试验发现，发酵液的田间防效好于化学药剂。因此，在果树休眠期采用伤口刮治结合涂抹生防菌剂的方法是理想的防治手段。此外，因为吐温可使不溶或难溶的液体形成稳定的乳浊液，所以有助于发酵液渗透到树皮下有效与病原菌接触，提高防治效果[37];黄原胶起到乳化、稳定、凝胶增稠的作用，使得发酵液膏剂不容易蒸发，耐雨水冲洗[38]，有助于发酵液在伤口处定殖进而抑制腐烂病菌。

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（责任编辑： 杨明丽）