南极磷虾副产物酶解蛋白胨工艺优化及实际应用

,2,2,*

(1.上海海洋大学食品学院,上海 201306;2.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海 201306)

目前制备蛋白胨多采用酶解的方法,目前制备蛋白胨多以单酶水解的方式,如王锡念[19]等利用风味蛋白酶、碱性蛋白酶水解鮟鱇鱼皮,所选取的风味蛋白酶具有内切蛋白酶和外切蛋白酶两种特性,因此酶切位点会更多,效果更好;碱性蛋白酶是内切蛋白酶,其主要酶切位点为Tyr、Phe、Trp[20-21]。有报道表明复合酶解效果高于单酶解,复合酶解包括复合酶分段水解和复合酶组合水解[22]。

本实验用南极磷虾副产物作为原料,利用风味蛋白酶、碱性蛋白酶进行复合酶分段水解制备蛋白胨,以水解率的大小作为衡量蛋白胨的得率的指标。利用风味蛋白酶和碱性蛋白酶分段水解,对比考察温度、复合酶比、时间、pH(为了简化工艺,整个反应过程中保持pH不变)对水解率的影响,对比大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌在南极磷虾蛋白胨、牛肉膏蛋白胨上的生长情况,测定其OD600,并绘制生长曲线。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

南极磷虾 捕捞于南极海域FAO48.2区,南极磷虾副产物包括南极磷虾的虾壳、虾足、虾头等,储存在-20 ℃冰箱冷冻备用;风味蛋白酶(酶活为2000000 U)、碱性蛋白酶(酶活为2000000 U) 无锡亨捷未央贸易有限公司;大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球 上海海洋大学微生物实验室;甲醛(36%～38%)、氢氧化钠、磷酸二氢钾、盐酸溶液 国药集团化学试剂有限公司(上海)。

超声波清洗器(KQ5200E) 上海一恒仪器有限公司;高压灭菌锅(LDZF-30KB-III) 上海四科仪器设备有限公司;高速冷冻离心机(H2050R) 长沙湘仪有限公司;凯氏定氮仪(K06) 上海晟声自动化分析仪器有限公司;无菌操作台(SZX-1) 上海浦东跃欣科学仪器厂;氨基酸自动分析仪(L-8800) 日本日立公司;紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 南极磷虾副产物制备蛋白胨工艺流程 南极磷虾副产物→解冻→加水均质(1∶4)→复合酶分段保温水解(先加入碱性蛋白酶,水解一定时间后再加入风味蛋白酶)[22]→灭酶(100 ℃,30 min)→冷却→离心(10000 r/min,30 min)→抽滤→南极磷虾酶解液→冻干(-80 ℃,36 h)→南极磷虾蛋白胨

1.2.2 加入风味蛋白酶时间的确定 准确称取10 g解冻后的南极磷虾副产物,与蒸馏水1∶4比例混合并均质。先加入碱性蛋白酶,分别在超声水解0.5、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 h后,再加入风味蛋白酶继续水解。碱性蛋白酶:风味蛋白酶为1∶1,总加酶量为1%,调节pH为至7.0,超声功率40 kHz温度50 ℃。整个反应时间为5.0 h后,100 ℃灭酶,静置冷却,10000 r/min的条件下离心30 min,比较最终水解率,以确定加入风味蛋白酶最适时间。

1.2.3 单因素实验 准确称取10 g解冻后的南极磷虾副产物,与蒸馏水1∶4比例混匀、均质。调节pH为至7.0,温度50 ℃,在超声功率为40 kHz下超声,先加入碱性蛋白酶,经上文1.2.2方法确定时间后再加入风味蛋白酶继续水解。碱性蛋白酶:风味蛋白酶为1∶1,总加酶量为1%,整个反应时间为5.0 h后,100 ℃灭酶,静置冷却后,10000 r/min离心30 min,测定氨基酸态氮的含量,依次考察温度、时间、复合酶比、pH对水解率的影响。

设定单因素的水平依次为温度(40、45、50、55、60、65 ℃),整个反应时间(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 h),复合酶比(3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3),pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)。

1.2.4 酶解工艺的正交实验 在单因素试验的基础上,以水解率为考察指标,对水解温度、时间、复合酶比和pH等影响因素进行综合考察,采用正交试验进一步优化南极磷虾副产物的水解工艺条件。正交试验设计结果如表1所示。

表1 酶解工艺的正交试验因素水平设定Table 1 Factors and levels for orthogonalexperiment of enzymatic hydrolysis

1.2.5 水解率的测定 水解率的计算公式为:

氨基酸态氮:根据GB5009 235-2016,测定南极磷虾蛋白胨中氨基酸态氮的含量。总氮量:采用GB 5009.5-2016凯氏定氮法。利用全自动凯氏定氮仪测定南极磷虾副产物(虾壳、虾足等均质后混匀)中总氮量[23]。

1.2.6 南极磷虾蛋白胨中游离氨基酸的种类及含量 根据GB/T 5009.124-2003处理样品,用氨基酸自动分析仪测定南极磷虾蛋白胨中的游离氨基酸种类及含量。

1.2.7 南极磷虾蛋白胨培养微生物的最适浓度 选取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5 g/L浓度的南极磷虾蛋白胨溶液为培养基,以1%的接种量,分别接种大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus),测定其OD600,确定每种微生物生长的最适浓度。

1.2.8 牛肉膏蛋白胨、南极磷虾蛋白胨微生物培养的效果比较 将大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)菌种活化后,以1%的接种量,分别接种到牛肉膏蛋白胨培养基中和南极磷虾蛋白胨(浓度根据1.2.7中确定)培养基中,在37 ℃的条件下,恒温培养24.0 h,每间隔2.0 h取一次菌液,以未接种的牛肉膏蛋白胨培养基、南极磷虾蛋白胨培养基为空白对比,测定OD600值,以OD600为纵坐标,以时间(h)为横坐标,分别绘制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨和南极磷虾蛋白胨上的生长曲线。

1.3 数据处理

应用Microsoft Excel 2016和SPSS Statistics 21.0进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 加入风味蛋白酶时间的确定

从图1可以看出,加入碱性蛋白酶后,若水解时间少于1.5 h就加入风味蛋白酶,则水解率较小;若在1.5 h后加入风味蛋白酶,则水解率较高且波动不大。因此确定加入风味蛋白酶的适宜时间为1.5 h。

图1 加入风味蛋白酶的时间对水解率的影响Fig.1 Effect of time of adding flavor protease on hydrolysis rate

2.2 单因素实验

2.2.1 温度对水解率的影响 由图2可知,当温度小于60 ℃时,水解率呈现递增趋势,温度大于60 ℃时水解率趋于平稳且略有下降,在60 ℃时水解率最高。风味蛋白酶的有效反应温度是30～60 ℃,碱性蛋白酶的有效反应温度是40～60 ℃[22],碱性蛋白酶的有效反应温度范围较风味蛋白酶小,两种蛋白酶有效反应的最高温度为60 ℃,选择温度不宜大于60 ℃,所以选择40、45、50、55、60 ℃进行正交实验。

图2 温度对水解率的影响Fig.2 Effect of temperature on hydrolysis rate

2.2.2 水解时间对水解率的影响 由图3可知,水解时间小于5 h时,水解率随水解时间的增加呈现上升趋势。当水解时间大于5 h后,水解率变化较为缓慢且略有下降。从时间和能耗耗方面考虑,继续酶解会增加成本,反应时间过长也可能因起蛋白酶变性,所以选择3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h进行正交实验。

图3 水解率随时间的变化Fig.3 Hydrolysis rate change with time

2.2.3 复合酶比对水解率的影响 由图4可知,在风味蛋白酶∶碱性蛋白酶=3∶1、2∶1、1∶2、1∶3条件下进行水解,其水解率均小于风味蛋白酶∶碱性蛋白酶=1∶1时的水解率。因此,适宜的水解复合酶比为1∶1。

图4 复合酶比对水解率的影响Fig.4 Effect of complex enzyme ratio on hydrolysis rate

图5 pH对水解率的影响Fig.5 Effect of pH on hydrolysis rate

2.2.4 pH对水解率的影响 由图5可知,随着pH的升高,水解率呈现下降趋势,在pH=5.0时水解率最高。碱性蛋白酶适宜的pH范围6.0～10.0,风味蛋白酶适宜的pH范围5.0～9.0,风味蛋白酶作用的适宜pH较碱性蛋白酶低,经过碱性蛋白酶作用后,为风味蛋白酶提供了更多底物,低pH更有利于风味蛋白酶的作用,本实验适宜的水解pH为5.0。

2.3 酶解工艺正交实验结果

由表2可知,各个因素对水解率影响的大小顺序为:A>C>D>B。酶解工艺的最佳组合为A5B5C3D1,即温度60 ℃、时间5 h、复合酶比1∶1、pH=5.0,在此条件下进行验证实验,得出的最大水解率为28.38%。由表3酶解工艺方差分析表可以得出,酶解温度对水解率有显著性影响(P<0.05)。

表2 酶解工艺正交实验结果Table 2 Results of orthogonal experiment of enzymatic hydrolysis

表3 酶解工艺的方差分析Table 3 Analysis of variance of enzymatic hydrolysis

注:*:表示差异显著,P<0.05。

表4 南极磷虾蛋白胨中游离氨基酸的种类及含量Table 4 Types and contents of free aminoacids in antarctic krill peptone

2.4 南极磷虾蛋白胨中游离氨基酸组成及含量

测定南极磷虾蛋白胨中游离氨基酸的种类和含量如表4所示。南极磷虾蛋白胨含有17种游离氨基酸,总游离氨基酸含量为(2968.83±35.1) mg/100 g。

2.5 南极磷虾蛋白胨培养微生物的最适浓度

由图6可知随着南极磷虾蛋白胨浓度逐渐增加,微生物的OD600值为递增趋势,当到达某一浓度,OD600值较稳定。当培养大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌的南极磷虾蛋白胨培养基浓度分别为3.5、5.0、4.0、4.5 g/L时,OD600值最大,大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌生长速率最高,因此培养大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌的最适浓度分别为3.5、5.0、4.0、4.5 g/L。

图6 南极磷虾蛋白胨溶液培养微生物的适宜浓度Fig.6 Suitable concentration of culturingmicroorganisms in antarctic krill peptone solution

2.6 微生物培养效果比较

2.6.1 大肠杆菌(E.coli)生长曲线的测定 图7为大肠杆菌在牛肉膏蛋白胨、南极磷虾蛋白胨上的生长曲线,在0～7 h处于延滞期,生长较慢、分裂迟缓。在8～14 h生长速度比较快,这时的大肠杆菌生长速率最快,这个阶段属于对数期,这个时期的的菌株最适宜做微生物接种的种菌。15 h之后大肠杆菌的菌体数量达到平稳,菌落群数最多,这个阶段为稳定期,营养物质减少,活的细胞数目较多。测得大肠杆菌在牛肉膏蛋白胨中的OD600仅比在南极磷虾蛋白胨中大0.077左右。

图7 大肠杆菌生长曲线Fig.7 The growth curve of E.coli

2.6.2 金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)生长曲线的测定 图8金黄色葡萄球菌在牛肉膏蛋白胨、南极磷虾蛋白胨上的生长曲线,在0～8 h处于延滞期,生长比较慢。在10～14 h生长速度比较快,这时的金黄色葡萄球菌生长速率最快,这个时期为对数生长期,这个时期的的菌株最适宜做微生物接种的种菌。14 h菌落总数最多,这个时期为稳定期,在这个时期培养基中微生物赖以生存的营养成分减少、微生物会产生有毒有害成分。测得金黄色葡萄球菌在牛肉膏蛋白胨中的OD600仅比在南极磷虾蛋白胨中大0.08左右。

图8 金黄色葡萄球菌生长曲线Fig.8 The growth curve of Staphylococcus aureus

2.6.3 枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)生长曲线的测定 图9为枯草芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨、南极磷虾蛋白胨上的生长曲线,0～7 h处于延滞期,分裂迟缓。在8～14 h生长速度比较快,这时的枯草芽孢杆生长速率最快,这个阶段属于对数期,这个时期的的菌株最适宜做微生物接种的种菌。15 h之后枯草芽孢杆菌的菌体数量达到平稳,菌落群数最多,这个阶段为稳定期,营养物质被减少,活的细胞数目较多。测得枯草芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨中的OD600仅比在南极磷虾蛋白胨中大0.076左右。

图9 枯草芽孢杆生长曲线Fig.9 The growth curve of Bacillus subtilis

2.6.4 蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)生长曲线的测定 图10为蜡状芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨、南极磷虾蛋白胨上的生长曲线,在0～9 h处于延滞期内生长比较慢。在10～14 h生长速度比较快,这时蜡状芽孢杆菌生长速率最快,这个时期为对数生长期,这个时期的的菌株最适宜做微生物接种的种菌。14 h之后处于稳定期,活细胞数目最多,在这个时期培养基中的营养物质开始减少、并产生乳酸等有机酸类,降低pH,菌体会生成一些有毒有害物质,导致之后会出现菌体自溶等现象。测得蜡状芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨中的OD600仅比在南极磷虾蛋白胨中大0.089左右。

图10 蜡状芽孢杆菌的生长曲线Fig.10 The growth curve of Bacillus cereus

3 结论

以南极磷虾副产物为原料,利用风味蛋白酶、碱性蛋白酶分段水解制备蛋白胨,最佳酶解工艺条件为:温度60 ℃、pH5.0、加入碱性蛋白酶水解1.5 h后,再加入风味蛋白酶继续水解解3.5 h,复合酶比1∶1,在此条件下进行验证实验,水解率为28.38%,得到的南极磷虾蛋白胨富含17种游离氨基酸,总游离氨基酸含量为(2968.83±35.1) mg/100 g。以南极磷虾蛋白胨溶液为培养基培养大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌的最适浓度分别为3.5、5.0、4.0、4.5 g/L,其在此浓度下OD600值最大,生长速率最高。测得4种微生物在牛肉膏蛋白胨中的OD600仅比在南极磷虾蛋白胨中大8%左右,说明南极磷虾蛋白胨可以替代牛肉膏蛋白胨作为微生物培养基的成分。本文为南极磷虾副产物的综合利用提供了一定的理论依据。