同种异体脂肪干细胞联合自体富血小板血浆凝胶修复大鼠皮肤软组织创面的临床效果

陈杏绮 罗志军 殷安柱 田 举 王和庚

伤口愈合是一种相互协调的动态组织修复过程，涉及多种细胞、生长因子、细胞因子等的相互作用，如何在微创或无创情况下促进伤口再生修复是目前医学领域研究的重点课题之一。脂肪干细胞（ADSCs）和富血小板血浆（PRP）是现阶段修复皮肤创面损伤的常用治疗技术，前者对真皮细胞外基质胶原的合成有着明显的刺激作用，可加快皮肤创面愈合速度；后者常用于抑制血管病变、促进组织修复和减轻炎症反应方面，同样有利于皮肤创面愈合[1-4]。然而现阶段这两种材料联合应用于创面愈合的临床研究较为少见[5]。本研究就同种异体ADSCs联合自体富血小板血浆凝胶对大鼠皮肤软组织创面的修复效果进行分析。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

40只SD大鼠，体重220～270 kg，购自中山市人民医院实验动物中心，自由进食进水，室温和湿度分别控制在20～24 ℃和60%～80%。麻醉药物为戊巴比妥钠，检测仪器包括全自动生化分析仪、真空采血管、巴氏管。

1.2 方法

动物模型建立和分组：术前3 d将大鼠背部鼠毛剔除，麻醉方式为40 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射，于大鼠背部行3 cm×3 cm全层皮肤缺损创面。将40只SD大鼠随机分为A组、B组、C组与D组，每组10只。

处理：A组创缘局部注射异体ADSCs悬液联合自体PRP，B组创缘局部注射异体ADSCs悬液，C组创缘局部注射自体PRP，D组采用0.9%氯化钠注射液静脉注射方式。（各组均在经碘仿与乙醇消毒后，对背部皮肤进行切除，形成创面，之后进行药物注射，1次/d，共治疗14 d。）

ADSCs原代细胞分离、培养与传代：对大鼠腹部脂肪组织进行体外分离培养，达到某种程度后实施培养扩增，取第3代ADSCs进行诱导分化实验对系间充质干细胞予以鉴别，适当扩充第3代ADSCs数量，为实验开展做好准备。

自体大鼠PRP分离、提取和保存：用含有ACD-A抗凝剂的真空采血管抽取7 ml静脉血，以1 500 r/min离心20 min，将上层血浆及邻近界面1 mm处的红细胞用巴氏管吸取至其他离心管中，以2 000 r/min离心10 min；底部薄层的白膜样物质为血小板沉积层，上方为血浆层，将大部分血浆吸取后，留下约0.5 ml血浆及血细胞成分；静置30 min后，轻晃离心管，直至红细胞与血小板在血浆中重悬，将得到的 PRP置于4 ℃冰箱中保存。

1.3 观察指标

比较 4组大鼠创伤面面积、创面愈合时间、微血管计数CD31细胞阳性表达率、Ⅰ型胶原蛋白含量和创面组织的转化生长因子-β1（TGF-β1）表达情况。分别在治疗3 d、7 d和14 d后，在大鼠创面表面覆盖透明薄膜，记录创面面积，根据美国国立卫生院研制出的Image J医学图像分析软件进行创面面积的计算[6]。CD31+、Ⅰ型胶原蛋白含量分别采用苏木精-伊红染色法（HE染色）和天狼星红染色法检测，采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测 TGF-β1表达情况。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 4组创面面积比较

治疗3 d后，各组大鼠创面面积均有所减小，A组创面面积明显小于 D组，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗7 d后，A、B、C组大鼠创面面积均明显缩小，与D组大鼠创面面积比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗14 d后，A组大鼠创面面积小于其他各组，差异有统计学意义（P＜0.05），B、C两组的创面面积比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 4组大鼠创面面积比较(cm2,±s)

表1 4组大鼠创面面积比较(cm2,±s)

注：与D组比较，aP＜0.05；与A组比较，bP＜0.05

组别 动物数 3 d后 7 d后 14 d后A组 10 2.68±0.21a 1.12±0.16a 0.08±0.02 B 组 10 2.95±0.18 1.51±0.18a 0.24±0.05b C 组 10 2.98±0.24 1.64±0.20a 0.30±0.06b D组 10 3.45±0.14 2.69±0.25 0.61±0.15b F值 26.623 112.133 70.669 P值 0.000 0.000 0.000

2.2 4组创面完全愈合时间比较

A、B、C组大鼠创面愈合时间均明显短于D组，差异有统计学意义（P＜0.05）；B、C两组大鼠创面愈合时间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 4组大鼠创面完全愈合时间比较(d,±s)

表2 4组大鼠创面完全愈合时间比较(d,±s)

注：与D组比较，aP＜0.05

组别 动物数 创面愈合时间A组 10 17.95±1.43a B组 10 18.26±1.54a C组 10 18.86±1.32a D组 10 23.15±1.28 F值 30.199 P值 0.000

2.3 4组微血管计数CD31细胞阳性表达率比较

治疗前，4组大鼠的微血管计数CD31细胞阳性表达率比较差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗后，各组大鼠微血管计数 CD31细胞阳性表达率均明显上升，A组大鼠微血管计数CD31细胞阳性表达率明显高于B、C、D组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3、图1。

2.4 4组Ⅰ型胶原蛋白和创面组织的TGF-β1表达率比较

4组大鼠接受治疗前的Ⅰ型胶原蛋白含量和创面组织的 TGF-β1表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗7 d和治疗14 d后，4组的Ⅰ型胶原蛋白含量和创面组织的TGF-β1表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表3 4组大鼠微血管计数CD31细胞阳性表达率比较(%,±s)

表3 4组大鼠微血管计数CD31细胞阳性表达率比较(%,±s)

注：与A组比较，aP＜0.05

组别 动物数 治疗前 治疗14 d后A组 10 40.28±3.24 82.35±3.28 B组 10 39.75±0.15 69.45±4.75a C组 10 40.42±3.18 67.86±5.12a D组 10 39.92±3.27 59.72±4.35a F值 0.094 44.693 P值 0.963 0.000

3 讨论

现阶段针对皮肤软组织创面的修复技术，包括植皮、皮瓣等，存在供皮区、供瓣区选择及局部破坏，移植区皮片、皮瓣成活情况不稳定等局限性。现有皮肤缺损创面外科修复方案存在一定缺陷，传统换药方式治疗创面起效慢，恢复周期长，伤口不易愈合，新技术修复效果尚未形成定论[7-9]。为探讨治疗该皮肤创面的有效治疗方案，一些医院采用组建大鼠模型的方式对该疾病的治疗展开探讨[10]。

干细胞存在于多种成熟组织中，对组织创伤有着明显的修复作用，将其从脂肪组织中进行分离的技术已有数十年历史，近年来已应用于临床中。ADSCs是从脂肪组织中分离而来，为具有多项分化潜能的干细胞，体外可继续稳定增殖，死亡率极低，具有良好的自我复制与多向分化能力，是人体组织器官的重要组成部分。在条件允许情况下，ADSCs可分化为骨细胞、软骨细胞等间质类细胞[11-12]。临床研究发现，ADSCs在皮肤创面修复过程中能够为血管的生成提供生长因子，也可促进抗凋亡细胞因子生成，加快创面愈合速度[13-14]。ADSCs还能够调节局部细胞对创伤的反应，增强组织修复，促进创面愈合。PRP是离心全血后得到的血小板浓缩物，其中富含血小板、血浆和生长因子，各种生长因子间有着良好的协同作用，可弥补单一生长因子刺激创面修复不佳的缺点，在促进新生血管再生过程中发挥着重要作用[15]。PRP中含有大量胶原蛋白，可收缩创面，刺激软组织再生，促进伤口早期闭合和防止感染。TGF-β在细胞增殖、分化和外基质分泌中发挥着重要作用，也可促进生物体免疫调节、胚胎发育、血管形成和创伤愈合的重建。同种异体ADSCs联合自体PRP可在治疗前期提高TGF-β表达，促进创面愈合，治疗后期表达率的下降可使瘢痕组织形成风险下降[16-19]。

表4 4组大鼠Ⅰ型胶原蛋白含量和创面组织的TGF-β1表达率比较(±s)

表4 4组大鼠Ⅰ型胶原蛋白含量和创面组织的TGF-β1表达率比较(±s)

Ⅰ型胶原蛋白(μg/L) TGF-β1表达率(%)组别 动物数 治疗前 治疗7 d 治疗14 d 治疗前 治疗7 d 治疗14 d A 组 10 0.28±0.05 1.21±0.14 2.35±0.42 60.48±2.15 81.62±3.24 61.28±1.54 B 组 10 0.30±0.05 0.85±0.09 1.72±0.35 61.21±2.52 73.58±3.25 63.12±2.32 C 组 10 0.29±0.06 0.81±0.15 1.64±0.28 60.96±2.78 71.60±2.14 63.98±2.84 D 组 10 0.32±0.04 0.56±0.08 1.24±0.16 61.75±2.44 65.25±1.65 64.78±2.58 F值 1.144 50.665 20.931 0.454 72.225 4.015 P值 0.345 0.000 0.000 0.716 0.000 0.015

异体 ADSCs取自多种同类型大鼠，与同体ADSCs比较，其免疫性低，可诱导免疫耐受，在促进移植动物存活和血管化过程中，不会引发明显的免疫排斥反应[20-21]。

联合应用异体ADSCs和自体PRP可充分发挥两者各自的优势，既利于新生血管再生，也可加快胶原蛋白分泌，提高组织中的Ⅰ型胶原蛋白含量；自体PRP的存在可促进异体ADSCs增殖、分化、成脂能力，更好地促进创面愈合；但PRP在促进创面愈合中的应用价值仍需展开进一步深入研究[22-24]。

本研究结果显示，4组大鼠接受治疗前的创伤面面积比较差异无统计学意义，4组大鼠治疗3 d后、7 d后和14 d后创面面积和创面完全愈合时间比较，差异有统计学意义；治疗后，各组大鼠微血管计数CD31细胞阳性表达率均明显上升，A组大鼠微血管计数CD31细胞阳性表达率明显高于B、C、D组，差异有统计学意义；治疗7 d和治疗14 d后，4组的Ⅰ型胶原蛋白含量和创面组织的 TGF-β1表达率比较，差异有统计学意义。

综上所述，同种异体ADSCs联合自体PRP治疗大鼠创面损伤，既可迅速缩减创伤面面积，缩短创面愈合时间，也在提高创伤大鼠的微血管计数CD31细胞阳性表达率、Ⅰ型胶原蛋白含量，改善创面组织的TGF-β1表达率方面发挥着重要作用，需要更深入的研究，为该技术在临床的应用中奠定基础，提高人性皮肤创伤疾病的治疗效果。