山茶籽对去卵巢大鼠血清护骨素和股骨骨组织的影响

顾建忠 李海 黄凌凌 陈建海 黎飚 杨洁 方晓燕

(右江民族医学院组织学与胚胎学教研室，广西 百色 533000)

Ⅰ型骨质疏松临床上也叫绝经后骨质疏松(PMOP)，绝经后卵巢萎缩退化，女性激素分泌锐减，护骨素血液随之下降，成骨细胞成骨功能得不到保护，反而破骨细胞功能亢进，引起溶骨大于成骨，导致总骨质量较少，骨质松散变脆，轻则腰酸背痛腿抽筋，重者骨折。临床雌激素(E2)对PMOP防治效果较好，但令人担忧是日益显现的毒副作用〔1，2〕。本研究主要探讨山茶籽对去卵巢大鼠血清护骨素和股骨组织的影响。

1 材料和方法

1.1材料 96只5月龄雌性SD大白鼠(300～350 g；SPF级)，榨油后的广西百色市凌云山区的山茶籽剩余物：茶麸，茶麸经过石油醚进行3次重复脱脂，用浓度为95%的乙醇3次回流得到提取沉积物，并将提取物合并，并进行低温浓缩至8.6 g/g生药的浓度，浓缩乙醇提取物经过无菌处理后置于冰箱2～5℃密封状态下保存备用。给实验大鼠用药再临时加无菌生理盐水配成5 g/g生药浓度的大鼠灌胃液。苯甲酸注射E2针剂 (每支100 μg，浙江省仙居制药有限公司，批号：20162086)。

1.2实验动物大鼠分组 在去卵巢和假手术之前把96只实验大鼠进行随机分成4组，假去卵巢(Sham)组、去卵巢动物模型(OVX)组、去卵巢+苯甲酸注射E2(E2)组、去卵巢+山茶籽醇提物稀释液(Ts)组，每组24只，分笼常规饲养，用标准规格饲料，饮水机自由给水。用药后各组大鼠通风、照明、湿度、温度和饲料各个饲养条件均相同。

1.3去卵巢动物模型建立 取OVX组、E2组、Ts组大鼠，配浓度为10 g/L戊巴比妥钠麻醉液，按3.0 mg/kg剂量，局部消毒后腹腔注射，待大鼠进入麻醉状态消毒条件下在背部双切开进入腹腔，切去两侧卵巢，切口由内向外依次分层缝合。切除所得卵巢的组织学块，经固定切片染色进行组织学鉴定确认。术后用注射卡那霉素液涂擦手术切口，连续3 d，避免手术切口化脓感染。术后1 w开始实验用药。Sham组操作方法和步骤同上，但不切去卵巢，只摘除贴附在卵巢的一近似卵巢大小块的脂肪块。术后用注射卡那霉素液涂擦手术切口，连续3 d，避免手术切口化脓感染。

1.4给药方法 (1)Ts组：将8.6 g/g的山茶籽醇提物加无菌生理盐水配成5 g/g生药浓度的大鼠灌胃液，按10 ml/(kg·d)剂量进行灌胃。(2)E2组，E2 200 μg/kg，左右两侧大腿交替皮下注射，注射口按压2 min，2次/w。(3)Sham组及OVX组，无菌生理盐水灌胃，按10 ml/(kg·d)剂量进行灌胃。

1.5检测指标及方法 各实验动物组从第4周起，每隔4 w处死一批大鼠。即第4、8、12和16周每组取6只实验大鼠，经腹腔注射浓度为10 g/L戊巴比妥钠溶液，按3.0 mg/kg剂量，进行腹腔适度麻醉，经左心室取血完毕后再，常规处死。(1)各组大鼠右侧股骨骨组织结构：分离右侧股骨，取股骨头1 cm，按常规骨组织制片过程：10%甲醛固定24 h、经酸溶液快速脱钙、梯度酒精脱水、热熔石蜡进行包埋，石蜡组织块冷却后进行切片，最后进行苏木素-伊红(HE)染色。放大200倍观察各组光镜骨组织结构；(2)各组大鼠左侧股骨骨钙：左侧股骨头剥离干净周围软组织，并取近端1 cm。取左侧的股骨头集中放置瓷性烤盘，并置恒温烤箱内，经105℃恒温烤48 h直到恒重。北京爱尚阳光科技有限公司的十万分之一实验室分析天平称其质量，将干骨置于坩埚进行炭化到无烟为止，把温度降到600℃，保持恒温1 h，加入20%的盐酸(HCl)轻轻搅拌至完成溶解，再加入去离子水到需要容量刻度，用上海美谱达仪器有限公司的WFX-IE2型原子吸收分光光度计进行股骨头骨钙测定。(3)用骨钙相同方法使股骨头烘干脱水至恒重，称其烘干股骨质量后，放入容量为10 ml的容器瓶中，注入20%的HCl于容器瓶中并封其口，把容器瓶放在恒温烤箱中，110℃恒温24 h，使股骨全部溶解。最后取出股骨容器瓶注入去离子水至相应容量刻度，用上海晶抗生物工程有限公司生产的磷试剂盒，上海光学仪器厂726型可见分光光度计测定股骨头骨磷的含量。(4)各组大鼠血清护骨素：大鼠麻醉后切开胸腔用采血器穿刺左心室吸取心血5 ml，经过离心器以4 000 r/min进行10 min离心分离，沉淀获取血清，置于低温(-20℃)冰箱保存。用酶联免疫吸附试验按试剂盒操作说明测定血清护骨素。

1.6统计学处理 采用SSPS18.0软件行方差分析。

2 结 果

2.1各组骨组织形态结构 Sham组骨组织骨质致密，骨皮质较厚，骨细胞规则密集，小梁粗且均匀，骨小梁排列有序，有明显横向连接。OVX组骨质薄，骨细胞稀少，骨小梁疏而细小、骨小梁断裂、紊乱，骨小梁之间腔隙较大，骨质明显疏松；E2组和Ts组与OVX组比较，骨皮质厚度和骨质密度明显增加，疏松骨质病理改善显著，骨质内部小梁较OVX组明显增密、增粗，骨质之间腔隙变小而少。E2组和Ts组骨组织切片放大200倍光镜下的结构形态相似。见图1。

2.2各组骨钙测量结果 OVX组在第4、8、12、16周采样骨钙显著低于同时期其他3组，差异有统计学意义(P<0.01)；Ts组第4、8、12、16周骨钙与同时期Sham组和E2组比较无显著差异(P>0.05)。见表1。

2.3各组骨磷测量结果 OVX动物组在第4、8、12、16周骨磷明显低于同时期其他3组(P<0.01)；Ts组第4、8、12、16周的骨磷与同时期Sham组和E2组比较无显著差异(P>0.05)，见表1。

2.4各组血清护骨素检测结果 OVX组在第4、8、12、16周血清护骨素显著低于同时期其他3组(P<0.01)；Ts组第4、8、12、16周血清护骨素与同时期Sham组和E2组比较无显著差异(P>0.05)。见表2。

组别骨钙第4周第8周第12周第16周Sham组170.35±10.471)168.69±16.231)170.12±12.201)171.60±11.301)OVX组148.26±12.22147.53±8.60146.59±10.16147.68±11.51E2组166.50±12.091)169.16±16.201)169.28±12.231)172.18±13.121)Ts组 162.40±13.431)164.59±15.361)166.26±13.651)168.29±13.281)组别骨磷第4周第8周第12周第16周Sham组101.20±10.31)99.89±12.181)97.58±10.141)98.98±13.101)OVX组80.33±10.3279.89±10.1580.40±9.7278.12±10.12E2组102.33±12.301)99.32±13.081)98.38±11.281)98.10±10.121)Ts组 97.20±10.061)96.22±11.211)95.12±13.051)96.82±12.321)

与OVX组比较：1)P<0.05；表2同

表2 各组血清护骨素检测结果

3 讨 论

骨质内钙化骨小梁多少用骨量表示，钙化的骨基质把骨细胞之间各种纤维包含在其中，形成坚硬骨基质，当成骨细胞功能优于破骨细胞功能时，骨小梁粗而密，骨质结实而坚硬；当成骨细胞功能劣于破骨细胞功能时，骨小梁小而疏，骨质变脆易断，也称为骨质流失，导致骨质疏松。当卵巢功能正常时，足量女性雌激素水平维持成骨细胞正常功能〔3〕，而拮抗破骨细胞，成骨细胞功能大于破骨细胞功能，骨质生成与流失平衡，骨质保持正常〔4～7〕。绝经期女性，卵巢退化，卵巢功能下降，低量女性雌激素水平不维持成骨细胞功能，而拮抗不了破骨细胞，成骨细胞功能劣于破骨细胞功能，骨质生成量小于流失量，骨量自然减少，骨质出现疏松〔8，9〕。雌性SD大鼠去卵巢很好模拟绝经女性卵巢功能退化导致雌激素水平下降所致骨质疏松，所以出现OVX组的骨钙、磷和血清护骨素明显低于其他3组。股骨头部骨质切片有显著骨小梁变小，变疏松的病理改变〔10，11〕。本研究结果表明雌激素可以提高成骨细胞功能的成骨功能，拮抗雌激素减少引起骨质疏松，提高血钙、磷和护骨素。也可能是雌激素通过增加护骨素，再通过护骨素提高成骨细胞的成骨功能，增加骨质生成，最终提高骨密度〔12，13〕。

本研究结果说明山茶籽醇提物有雌激素样作用，属于植物性雌激素。山茶籽醇提物可以提高护骨素，增加骨量，拮抗雌激素减少导致的骨质疏松〔14，15〕。如果进一步实验证明山茶籽醇提物能防治PMOP，将为临床防治PMOP提供实验依据。如果临床推广山茶籽醇提物防治PMOP，可以大大减轻雌激素防治PMOP毒副作用，不仅提高患者生活质量，减轻社会和家庭负担，也可以使广大山区的山茶籽榨油后的茶麸充分利用，大大提高其经济效益。