早期肺癌患者细胞活性氧变化水平与免疫功能的相关性

佐热古丽·热依木 吐尔逊·买买提 贝力克孜·麦麦提 姚爱荣

(1阿克苏职业技术学院医学系,新疆 阿克苏 843100；2阿克苏地区第一人民医院检验中心)

据统计，目前中国男性肺癌的发病率为5.09万人/年，中国女性肺癌的发病率也达2.24万人/年〔1〕。活性氧(ROS)是机体氧化应激反应时产生的，在肿瘤发生、发展中起重要作用。在免疫功能调节中，细胞质膜上的还原型烟酰胺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶同源物(NOX)2参与细胞反应生成ROS，其存在影响淋巴细胞的生成与成熟〔2,3〕。本研究主要分析ROS与免疫功能的相关性。

1 资料与方法

1.1临床资料 选取2016年6月至2017年12月阿克苏地区第一人民医院收治的肺癌患者87例为肺癌组，年龄52～73岁，平均62.61岁，男52例，女35例；按ROS水平不同分为3组，ROS<35.0为C组，35.0

1.2主要仪器及试剂 RPMI1640培养基(购自美国sigIlla公司)，胎牛血清(购自美国Gibco公司)，肺泡细胞(购自中国科学院上海细胞库)，2'-7'-二氧二氢荧光素二乙酸酯(H2DCFDA)染液(购自上海皓元生物医药科技有限公司)，酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(购自上海科华生物技术有限公司)，ROS水平检测试剂盒(购自上海翊圣生物科技有限公司)，流式细胞仪〔购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司〕。

1.3细胞分离和培养 取术中切除的肺癌组织，立即浸泡于无菌的Hank液中，脉冲式反复冲洗多次后，用组织剪剪成1.0～1.5 mm3碎块状，加入0.25%胰蛋白酶溶液和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化液，量约为碎块组织混合液的10倍，在37℃温度下消化30 min，每5 min摇动1次，将消化液除去，以不含血清的RPMI1640培养液多次冲洗剩余组织，然后加入适量培养液，以巴氏管反复吹打组织液至单细胞状态〔4,5〕。在细胞中加入RPMI1640完全培养基(含10%胎牛血清)，摇晃均匀后，在1 000 r/min下离心10 min，将上清液倒掉，加入5 ml细胞培养液悬浮细胞后，接种到细胞培养瓶中，在37℃，5%CO2的培养箱中培养。观察细胞密度>90%时，弃去细胞培养液，加入0.25%的胰蛋白酶消化细胞，在1 000 r/min下，离心10 min，用适量RPMI1640完全培养基悬浮细胞后，按照不同比例接种到细胞培养瓶中继续培养〔4,6〕，同法进行正常肺泡细胞培养。

1.4ROS水平测定 将培养的肺癌细胞以每孔4×103个细胞接种到96孔细胞培养板上，在37℃，5%CO2培养箱中培养48 h后，弃去上清液，将H2DCFDA染液(5 μmol/L)按每孔100 μl加入，避光条件下反应30 min后，利用激光扫描共聚焦显微镜检测细胞荧光强度，激发波长和吸收波长分别为380 nm和532 nm，荧光强度即代表ROS水平〔7,8〕，同法测定正常肺泡细胞中ROS水平。

1.5免疫功能测定 术前采集患者空腹静脉血5 ml，采用流式细胞仪检测T 淋巴细胞亚群(CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)、自然杀伤(NK)细胞百分比〔5,9〕；用ELISA测定空腹静脉血中可溶性白细胞介素-2受体(sIL-2R)水平〔10〕。

1.6统计学方法 采用SPSS22.0软件进行配对t检验。

2 结 果

2.1两组ROS水平比较 肺癌组ROS水平与对照组比较明显升高(P<0.05)。

2.2两组免疫功能水平比较 肺癌组CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、NK细胞百分比、sIL-2R与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.3肺癌患者细胞中ROS水平与免疫功能相关性比较 A、C组免疫功能水平除CD4+/CD8+显著高于B组，其余指标均显著低于B组，A、B、C三组免疫功能水平除CD4+/CD8+显著低于对照组外，其余指标均明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 肺癌患者细胞中ROS及T淋巴细胞水平测定

与对照组比较：1)P<0.05；与B组比较：2)P<0.05

3 讨 论

肺癌是恶性肿瘤中治疗效果相对较差的一种癌症，5%的肺癌病患在初诊时即已发生远处转移，而外科手术治疗无疑是现在最直接有效的治疗方法，目前多种微创外科治疗方法在肺癌的治疗中发挥了强大优势，结合后续放疗和化疗等治疗手段，临床疗效正在逐步提高。但肺癌患者机体免疫力往往很差，这在客观上限制了上述治疗方法的应用。相关文献报道提示ROS是影响人体衰老、染色体畸变、细胞凋亡、肿瘤发生及进展的重要分子物质〔11～14〕，随着对ROS研究的深入，对其认识也更加全面，ROS参与多种途径的信息传递过程，参与多种生物学效应，在氧化还原敏感性基因调节等过程中起重要作用〔15,16〕。本研究在通过对相关文献报道整理总结的基础上，提出了对早期肺癌患者癌细胞中ROS水平与机体免疫力的相关性研究，旨在探索两者相关性，为进一步研究提高免疫力和肿瘤治疗寻找可靠依据。

ROS的双向生物学效应吸引了众多研究者对其特性、作用过程、影响因素等进行深入研究。ROS在细胞线粒体内膜上的电子传递链过程中产生，在有氧呼吸过程中，真核细胞中多数可产生不同浓度的ROS作用于信号传递。ROS最先发现于吞噬细胞，随着相关检测技术的发展，陆续在T、B淋巴细胞中发现ROS，尤其是在T淋巴细胞受体活化后的极短时间内其细胞内即可检测到ROS生成，说明ROS是T淋巴细胞受体活化过程中的重要作用分子之一〔17〕。研究数据显示，淋巴细胞主要通过细胞膜上NOX2作用生成，而实验动物体内后者功能缺失的T淋巴细胞中ROS的生成量显著减少且对慢性肉芽肿性病(CGD)易感，这说明机体免疫系统中ROS 的主要来源于NOX2〔18〕。

ROS在机体遭遇病原体侵入后可大量产生，成为机体防御病原体的武器，目前其产生的超氧化物对于病原体的防御杀伤能力还未有明确定论〔2〕，但超氧化物可进行后续反应生成相对稳定的过氧化氢(H2O2)，而H2O2可反应达到杀伤病原体的目的〔2〕。ROS可提高NK细胞的活性且介导NK细胞的病原体溶解作用。Case等〔19〕在ROS影响胸腺T细胞发育成熟的实验中，提高胸腺组织中ROS浓度后T细胞发育明显受到抑制且影响获得性免疫功能的成熟。

对于肺癌患者，提高免疫力治疗是整个治疗方案和过程中极为重要的一项治疗措施，但由于癌细胞转移、肺功能下降等因素制约，许多肺癌患者免疫力十分低下，后续治疗效果欠佳。ROS对机体具有双重效应，是一把双刃剑，我们可通过对肺癌细胞中ROS水平的测定与机体免疫功能水平相对比，进一步把握两者之间的相关性，为制定肺癌患者治疗方案提供参考。本研究中数据分析显示，肺癌患者癌细胞内ROS水平较正常肺泡细胞明显增高，提示ROS在肺癌发生、发展中起重要作用。机体免疫功能水平与肺癌细胞中ROS浓度水平具有明显依赖性，ROS低浓度的增高有助于机体免疫功能提高，高浓度的增高使得机体免疫功能下降，相关性呈现波峰状态。

随着现代检测技术的发展，对ROS的研究也越来越深化和多元，ROS在肿瘤发生、发展及转移中的具体作用机制正在被一步步剖析，在对机体免疫力调节方面的作用也日益凸显，本研究通过阐述肺癌细胞中ROS水平与免疫功能强弱之间的关系，为早期肺癌患者提高免疫力和肿瘤治疗寻找最佳契机。我们可以通过调控肺癌细胞中ROS水平至适当浓度，使机体具有最佳免疫功能，结合提高免疫力药物治疗，为肿瘤治疗方案的施行创造机会。后期，我们将继续探索免疫功能最佳的肺癌细胞中ROS浓度靶点，为临床研究提供依据，为肺癌的治疗营造更好的机体条件。