B族链球菌快速筛查及耐药性检测多重PCR体系构建

祝丽晶，潘 艳，陈小颖，侯盼飞*

(1.涟水县人民医院 检验科，江苏 涟水223400;2.上海交通大学医学院附属仁济医院，上海200127)

B族链球菌(group B Streptococcus，GBS) 又称无乳链球菌，为革兰阳性球菌，多分布于下消化道及泌尿生殖道，是围产期感染的主要致病菌。妊娠期感染可引起早产、流产、胎膜早破、胎儿窘迫等，并可引起新生儿肺炎、脑膜炎、败血症、窒息等[1]。研究显示，在妊娠期对GBS筛查并对阳性者进行干预治疗，可明显降低妊娠不良结局和新生儿早发性疾病的发生[2]。本研究旨在建立GBS快速筛查及克林霉素、红霉素耐药性的多重PCR方法，为GBS的筛查、快速诊断和指导临床用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1菌株来源 GBS阳性菌株为我院临床标本分离，经细菌培养鉴定为GBS，药敏显示对克林霉素、红霉素均耐药，并经普通PCR证实cfb、ermB和linB基因均阳性。

1.1.2试剂 Taq酶、dNTPs、Buffer等PCR反应试剂及DNA 提取试剂盒均购自上海闪晶分子生物科技有限公司。

1.1.3仪器 PCR扩增仪购自美国ABI公司，电泳仪购自上海天能有限公司，凝胶成像仪购自美国Protein Simple公司。

1.2 实验方法

1.2.1DNA提取 采用煮沸法提取基因组DNA，具体操作按DNA提取试剂盒说明书进行。

1.2.2引物 通过Primer5.0软件结合文献报道[3]设计引物(序列如表1所示)，由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 目的基因引物序列及预扩增产物

1.2.3多重PCR反应体系 总体系采用25 μl，包括：PCR buffer(含MgCl2)10 μl，dNTPs 1 μl，DNA模板0.5 μl，四对引物各0.5 μl，Taq酶0.5 μl，无菌去离子水补充至25 μl。

1.2.4多重PCR反应条件 94℃预变性3 min；94℃变性30 s，退火50 s，72℃延伸1 min，共30个循环；最后72℃延伸 5 min。为探求最佳退火温度，我们根据引物的Tm值在50-60℃间每隔1℃设定1个退火温度，从而优化反应条件。

1.2.5电泳 PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳，观察特异性条带。

2 结果

成功构建GBS快速筛查和耐药检测的多重PCR反应体系，并对退火温度进行优化。当退火温度高于58℃时，linB基因未扩增出目的条带。当温度降至55℃以下时，会出现非特异性条带。退火温度为56℃时，3对基因均扩增出目的条带，且亮度最为清晰。故多重PCR最适退火温度为56℃,如图1所示。

注： 1-6退火温度分别为59℃、58℃、57℃、56℃、55℃、54℃；M： Marker.

图1 不同退火温度多重PCR产物电泳图

3 讨论

GBS是围产期妇女感染的主要致病菌，对孕产妇及新生儿都可造成重大危害。欧美国家对GBS的检测开展较早，美国疾病控制中心2010年《围生期 B 族链球菌感染筛查及防治指南》提出：对所有孕妇于妊娠35-37 周采集阴道及直肠拭子进行 GBS 筛查，并对阳性者进行干预治疗[4]。我国对GBS 的研究起步较晚，2010 年前全国范围内的筛检几乎空白。《孕前和孕期保健指南(2018)》将孕期GBS筛查列为备查项目[5]。青霉素是治疗GBS的首选药物，据报道有12%的孕妇对青霉素过敏[6]，且近年来GBS对青霉素的不敏感率也逐渐增高[7,8]。美国疾控中心推荐对青霉素过敏者可根据药敏试验结果选择克林霉素或红霉素，因而快速鉴定GBS 并检测其对克林霉素、红霉素的耐药性具有重要意义。

GBS检测方法主要有微生物培养法和分子生物学方法。培养法是确诊GBS感染的金标准，鉴定的同时还可进行药敏试验。缺点是检测时间长、干扰因素多，灵敏度低[9]。PCR技术作为一种重要的分子生物学方法，近年来受到越来越多研究者的青睐。其具有实时、快速、准确等优点，适用于围产期筛查和紧急情况下的快速检测，主要缺点是无法进行药敏试验[10]。我们在前期耐药性监测、流行病学分析的基础上明确了本地区GBS的主要耐药机制，选择CAMP因子的cfb基因、红霉素耐药基因 ermB、克林霉素耐药基因linB为靶基因，设计引物构建多重PCR反应体系，鉴定、药敏同步完成，一次检测多种基因，比普通PCR节省了时间和试剂[11]。影响多重PCR的一个关键因素是引物设计，我们在严格按照引物设计原则的同时还要注意引物的特异性、避免形成引物二聚体、扩增产物大小易区分。另一个关键因素是退火温度，我们对退火温度进行了探索，当退火温度在56℃、57℃时，均能扩增出3条目的条带而不出现非特异性扩增，在56℃时，条带最为清晰，是多重PCR的最适退火温度。

本研究成功构建GBS快速筛查和耐药性检测的多重PCR反应体系，在快速鉴定的同时可进行克林霉素、红霉素耐药性分析，弥补了普通PCR无法进行耐药性检测和培养法耗时长、阳性率低的缺点。下一步我们将对该方法灵敏度、特异性等指标进行评价，并在临床推广，这对GBS常规筛查、紧急情况下的快检和青霉素过敏者的治疗均具有重要意义。