甲状腺结节穿刺物中miRNA-221和miRNA-125的表达及意义*

张双元,梅士娟,孔令达,张晨如,措 羊,张易青,马淑梅

(1.青海大学附属医院肿瘤外科二科，西宁 810001；2.青海大学医学院临床医学系,西宁 810001;3.青海大学附属医院病理科,西宁 810001;4.青海大学附属医院超声科,西宁 810001)

随着超声检查的普及和诊断技术的提高，甲状腺结节成为最常见的内分泌疾病和临床难题[1-2]。如何在术前快速、有效地明确甲状腺结节的良恶性困扰着外科医生。细针穿刺细胞学检查(fine-needle aspiration biopsy，FNAB)是术前评估甲状腺结节灵敏度、特异度最高的方法[3-4]，但仍有20%～30%的病例不能明确诊断[5]。已有研究发现甲状腺癌组织中miRNAs表达紊乱[6]，本文选择FNAB后良恶性未能明确的甲状腺结节患者，检测穿刺物中miRNA-221、miRNA-125的表达量，研究其与甲状腺结节良恶性诊断的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2016年6月至2018年8月青海大学附属医院肿瘤外科二科收治的138例经FNAB后良恶性不明确的甲状腺结节患者。入组标准：(1)甲状腺结节经超声引导下FNAB提示甲状腺细胞病理学Bethesda报告系统中Ⅲ类或Ⅳ类；(2)穿刺物足够检测2种微小核糖核酸；(3)无其他肿瘤性疾病；(4)全身麻醉下进行甲状腺结节切除手术；(5)组织病理学资料及病历资料完整。排除标准：(1)凝血功能障碍；(2)细胞学诊断考虑甲状腺细胞病理学Bethesda报告系统中Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅵ类；(3)伴有其他肿瘤性疾病；(4)穿刺物不能满足检测2种微小核糖核酸；(5)未进行手术，组织病理学资料不完整；(6)病历资料不完整。

1.2实验试剂与仪器 RNA保存溶剂Trizol(美国Invitrogen公司，货号：15596026)，总RNA提取试剂盒miRNeasy Mini Kit(德国QIAGEN公司，货号：217004)，反转录试剂盒TaqMan MicroRNA(美国ABI公司，货号：4366596)，荧光定量PCR扩增试剂盒TaqManTMUniversal Master Mix II,no UNG(美国ABI公司，货号：4440043)，Mastercycler®ep realplex型实时荧光定量PCR仪(德国Eppendorf公司)，miRNAa定量扩增试剂盒TaqMan®MicroRNA assays(美国ABI公司)，无RNA酶、无DNA酶、无热源的枪头、离心管等(美国Axygen公司)。

1.3方法

1.3.1穿刺物 2%利多卡因局部麻醉下进行穿刺操作。在实时超声引导下采用细针(22～25G)进行甲状腺结节穿刺，显示针尖在实性病灶内后重复提插数次完成取材，每个结节穿刺2～3次。拔出穿刺针后，立即将细针穿刺物涂于载玻片上制作薄层涂片2张，固定，送细胞学检查。剩余穿刺物直接置入RNA保存溶剂 Trizol中保存，放入-80 ℃超低温冰箱保存。

1.3.2检测miRNA-221-3p、miRNA-125b-5p的表达 按照文献提供的标准方法对甲状腺结节穿刺物进行RNA提取，反转录，每个样本均应用TaqMan荧光探针检测miRNA-221-3p、miRNA-125b-5p的表达量。

1.3.3病理学诊断 在气管插管全身麻醉下施行手术。患者仰卧、取颈部过伸位。先进行甲状腺结节切除手术，根据术中冰冻病理诊断结果确定原发病灶手术范围：单侧甲状腺腺叶次全切除术、单侧甲状腺腺叶切除术或全甲状腺切除术。病理科医生将手术切除的甲状腺结节制作成石蜡切片：包括取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、烤片和脱蜡、染色、封片等步骤。两名副主任医师以上职称的病理科医师进行诊断。其中良性甲状腺结节94例，恶性甲状腺结节44例。

1.4统计学处理 采用SPSS19.0 统计软件进行分析。计量资料以中位数(四分位数间距)表示，采用Mann-whitney秩和检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1miRNA-221-3p、miRNA-125b-5p在甲状腺结节中的表达 miRNA-221-3p、miRNA-125b-5p的表达在恶性组中相对于良性组均明显上调，差异有统计学意义(P<0.001)，见表1。

表1 良恶性甲状腺结节中miRNA-221-3p、miRNA-125b-5p的表达量[M(Q25,Q75)]

2.2miRNA-221-3p、miRNA-125b-5p诊断恶性甲状腺结节的灵敏度和特异度 miRNA-221-3p诊断恶性甲状腺结节的CUT-OFF值为1.445 0，miRNA-221-3p表达量低于1.445 0认为是良性结果，高于1.445 0则认为是恶性结果，灵敏度为0.864，特异度为0.745，约登指数为0.609，AUC为0.804，见表2、图1。miRNA-125b-5p诊断恶性甲状腺结节的CUT-OFF值为1.845 0，miRNA-125b-5p表达量低于1.845 0认为是良性结果，高于1.845 0则认为是恶性结果，灵敏度为0.750，特异度为0.777，约登指数为0.527，AUC为0.763，见表3、图2。

表2 miRNA-221-3p诊断恶性甲状腺结节的灵敏度和特异度(n)

图1 miRNA-221-3p诊断恶性甲状腺结节的ROC曲线

表3 miRNA-125b-5p诊断恶性甲状腺结节的灵敏度和特异度(n)

图2 miRNA-125b-5p诊断恶性甲状腺结节的ROC曲线

2.3miRNA-221-3p联合miRNA-125b-5p诊断恶性甲状腺结节的灵敏度和特异度 联合检测miRNA-221-3p、miRNA-125b-5p进行诊断，即miRNA-221-3p表达量高于1.445 0且miRNA-125b-5p表达量高于1.845 0，甲状腺结节为恶性。灵敏度为0.705，特异度为0.904，约登指数为0.609，AUC为0.804，见表4、图3。

表4 miRNA-221-3p联合miRNA-125b-5p诊断恶性甲状腺结节的灵敏度和特异度(n)

图3 miRNA-221-3p联合miRNA-125b-5p

3 讨 论

FNAB是甲状腺结节术前最精准的病理诊断方式，灵敏度89%～98%,特异度92%[7],用于术前鉴别甲状腺结节的性质。诊断标准采用甲状腺细胞病理学Bethesda报告系统。FNAB后仍有20%～30%不能明确诊断。FNAB诊断不明确甲状腺结节是指甲状腺细胞病理学Bethesda评分系统中Ⅲ类意义不明确的细胞非典型性病变或意义不明确的滤泡性病变及Ⅳ类滤泡性肿瘤或可疑滤泡性肿瘤。因存在恶性风险，对于这部分甲状腺结节，临床医生均会建议患者进行甲状腺结节切除手术。然而，手术切除的甲状腺病变经组织病理学证实84%为良性[8]。因此，临床需要新的诊断技术提高FNAB后良恶性诊断不明确甲状腺结节的确诊率，从而减少未明确甲状腺结节的良恶性而进行的诊断性甲状腺切除手术。高分辨率超声能够确定甲状腺结节的囊实性质、个数、大小、纵横比、硬度、包膜是否完整、有无血流信号及淋巴结的状态。本文甲状腺结节FNAB在超声实时引导下进行。对于囊实性甲状腺结节，依靠触诊引导进行的穿刺检查不能准确刺入实性部分，获得的细胞数目少，诊断价值不高；而超声引导下甲状腺结节FNAB使穿刺目标更为准确，提高囊实性病变实性部分的取材成功率，同时有利于穿刺过程中对重要组织结构的保护、判断穿刺后有无血肿。与触摸甲状腺结节穿刺相比，超声引导下能获得更好的代表性样本，诊断准确率高[9]。

近年来，采用细针穿刺获取物检测分子标记物进行甲状腺结节诊断取得了很大进步。已有研究显示[10-12]，分析BRAF、RAS、TERT、TP53等基因的突变可预测甲状腺恶性病变。但2015版甲状腺癌ATA指南并未推荐用于细针穿刺后未能明确良恶性的甲状腺结节患者[3]。miRNA是一类由19～25个核苷酸组成的细胞内源性表达的非编码小分子RNA，广泛存在于脊椎动物、果蝇、线虫等各种生物中，具有高度保守性。CASTAGNA等[13]分析了甲状腺结节细针穿刺物中11种微小核糖核酸的表达,认为miRNA146b、miRNA-221、miRNA-222在恶性或可疑恶性甲状腺结节中的表达高于良性甲状腺结节。DETTMER等[14]应用miRNA芯片检测发现，在滤泡状甲状腺癌(FTC)肿瘤组织中miR-182/-183/-221/-222/-125a-3p的表达增加，miR542-5p/-574-3p/-455/-199a 的表达下降。AGRETTI等[15]报道,miR-30d、miR-125b、miR-26a、miR-30a5p 在未分化甲状腺(ATC)组织中的表达明显低于正常对照甲状腺组织，miR-146b、miR-221、miR-222 在 ATC 组织中的表达明显高于多结节甲状腺肿组织，且 miR-221 和 miR-222 在石蜡包埋 PTCs、FTCs、ATCs 等甲状腺肿瘤组织中明显高表达。因此，了解甲状腺癌中特异性 miRNAs 表达谱的变化，有望应用于甲状腺癌的诊断、高危人群的普查、 肿瘤预后评价、预测肿瘤转移和复发。

本研究发现，miRNA-221-3p良性组表达量为0.825，恶性组表达量为4.305； miRNA-125b-5p良性组表达量为1.085，恶性组表达量为2.690。恶性组中miRNA-221-3p、miRNA-125b-5p的表达量相对于良性组均明显上调。miRNA-221-3p诊断的灵敏度0.864，特异度0.745；miRNA-125b-5p诊断的灵敏度0.750，特异度0.777；miRNA-221-3p联合miRNA-125b-5p诊断时灵敏度0.705，特异度0.904。这提示甲状腺结节患者在FNAB后不能判定良恶性的情况下，进一步检测miRNA-221-3p、miRNA-125b-5p的表达量有助于评估甲状腺结节的良恶性，减少不必要的诊断性甲状腺手术，可以避免患者额外承受的病痛，有利于减少医疗资源的浪费。

本研究的不足：(1)研究的微小核糖核酸的种类少，增加种类是否有助于确定甲状腺结节的良恶性有待于进一步研究；(2)细针穿刺物中miRNA-221-3p、miRNA-125b-5p检测与患者的病理学特征结合是否能够进一步提高术前评估甲状腺结节的良恶性有待于下一步研究；(3)研究病例数少，诊断甲状腺结节恶性的阈值需进一步确定。

综上所述，在FNAB不能确定甲状腺结节的良恶性时，进一步检测miRNA-221-3p、miRNA125b-5p的表达量有助于临床医生评估甲状腺结节良恶性，减少不必要的诊断性甲状腺手术。但miRNA-221-3p、miRNA-125b-5p的表达量达到多少阈值具有更佳的灵敏度和特异度需要增大病例数进一步研究。