miR-126的细胞周期调控分析

钱程 李宪孟 周晓

不同类型的肿瘤存在特殊的miRNA 表达谱[1]。miRNA 可对细胞周期进程中的蛋白质分子进行调控，而其表达水平的高低可影响细胞周期进程，当失去对细胞周期进程的控制时，可增加肿瘤疾病的发生率。而miRNA 可在细胞周期进程中充当癌基因与抑癌基因而发挥作用[2-3]。为观察miR-126 在肝癌细胞中的表达及其与细胞周期调控的关系，对miR-126 在肝细胞肝癌的临床应用中的生物学功能进行初步探究，本组实验选取45 例肝癌患者作为本次实验的观察对象，分别利用荧光定量PCR 及原位杂交法对所选取45 例肝癌患者的癌细胞及其癌旁组织进行检测，观察miR-126 的表达水平，现将本次实验过程报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取45 例肝癌患者作为本次实验的观察对象，患者中有男性27 例，女性18 例，患者的年龄范围介于47～69 岁，平均年龄（55.51±4.34）岁；疾病类型：肝细胞癌40 例，肝胆管细胞癌5 例；高中分化肝癌38 例，低分化肝癌7 例；所有患者均于2017 年1 月—2018 年1 月间我院收治的肝癌患者的手术切除标本，该手术切除标本选取自肝癌肿瘤中心部位及对应的癌旁正常组织，手术切除标本取出后立即进行病理检查后利用液氮速冻保存备用。分别利用荧光定量PCR 及原位杂交法对所选取45 例肝癌患者的癌细胞及其癌旁组织进行检测，观察miR-126 的表达水平，并利用流式细胞仪对患者肝癌细胞进行细胞周期检测，分析miR-126 的表达水平与细胞周期的关系。

1.2 方法

荧光定量PCR 检测。采用Trizol 法将患者的肝癌组织与癌旁正常组织的mRNA 进行提取，利用M-MLV 逆转录酶完成逆转录，逆转录引物[4]：5’-GTCGTATCCAGTGCAGG GTCCGAG GTATTCGCACTGGATACGACACAAAC-3’；RT-PCR 的 引 物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’，选用U6 RNA 作为内参基因，设定PCR 环境条件为95℃ 15 s，60℃ 30 s，试剂选用配套试剂，完成40 个循环。相对定量计算公式：肿瘤组织miR-126 相对表达量=2（Ct1-Ct2）/2（Ct3-Ct4），其中：Ct1：癌旁组织miR-126 的CT 值，Ct2：癌旁组织U6 RNA 的Ct 值，Ct3：肿瘤组织miR-126 的CT 值，Ct4：肿瘤组织U6 RNA 的Ct 值[5-6]。

原位杂交。本次实验原位杂交的检测探针选用5’-CAAAC ACCATTGTCACACTCCA-3’，将生物素（普洛麦格（北京）生物技术有限公司）标记于3’末端，将检测试剂备好开始检测[7]。对获得的组织切片进行脱腊处理，脱腊完成后将HCL（0.2 mol/L）作用于组织切片中持续5 min，完成后在室温条件下利用多聚甲醛（4%）对其持续固定10 min，将蛋白酶K（4 μg/mL）在25℃环境中置入PBS 溶液中连续清洗2 次，PBS 配方为甘氨酸（0.2%），然后在4 倍SSC 缓冲液中保持15 min 中和平衡，将预先准备好的由去离子甲酰胺（50%）+葡萄糖硫酸酯（10%）+Denhardt’s Buffer（1×）+DTT（10 mmol/L）+SSC（4×）+酵母tRNA（1 mg/mL）混合液对其进行滴加，结束后将混合液置入恒温箱，设定恒温箱温度为42℃左右进行预杂交，将多余液体吸出，将100 μL 含有探针终浓度1 mg/mL 的预热变性杂交液加入前述吸出液中置于切片上，用盖玻片完全覆盖置入恒温箱中，设定恒温箱的温度为42℃开始过夜孵育；取出切片，将盖玻片移除，将切片置于SSC（4×）环境中进行洗涤，每次洗涤15 min，共进行2 次。再将切片置于SSC（1×）环境中进行洗涤，每次洗涤15 min，共进行2 次，再将切片置于由PH 为7.5 的Tris-HCL（0.1 mol/L）+NaCl（0.15 mol/L）+Tween-20（0.1%）组成的TBST 混合液中进行洗涤，每次洗涤10 min，共进行2 次后，将具有HRP 标记的工作浓度为1：500 的抗生物素抗体滴入切片中，于环境温度为4℃的条件下静置12 h，静置完成再将切片利用前述TBST 混合液洗涤，每次洗涤15 min，共进行2 次，将切片利用DAB 染色液进行显色，由操作人员在显微镜下对切片颜色进行观察[8]。

流式细胞术。将新鲜的手术标本取出后剪碎并在蛋白酶K 的影响下完成消化[9]，利用200 目钢制进行单细胞悬浊液的制备，最终降细胞浓度调整为1×106mol/L，将预冷酒精（95%）加入制得的单细胞悬浊液中直至其浓度降为70%，并在冰浴环境下固定60 min；结束后将溶液置入离心机，设定离心机频率为1 000 r/min，开始10 min 离心操作，将溶液内乙醇去除，在PBS 环境下重悬细胞，然后向溶液中缓慢加入PI 染液将溶液浓度逐步降至50 μg/mL，RNase 条件下直至终浓度调整为10 μg/mL，将最终溶液在室温环境下遮光持续30 min 的孵育，取出孵育后溶液置入流式细胞仪中进行细胞周期的分析。

1.3 统计学方法

本次实验数据分析采用SPSS 18.00 统计学软件，其中计数资料的表示与检验方式分别为“（%）”与“χ2检验”；计量资料的表示与检验方式分别为“（±s）”与“t检验”，组间以“P”表示差异性，当P＜0.05 时两组数据差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 荧光定量PCR 法检测肝癌组织中miR-126 的表达

在本次实验的45 例肝癌患者的肝癌组织标本中的miR-126 相对表达量为癌旁正常组织的（17.73±9.21）%，38 例高中分化肝癌组织中的miR-126 相对表达量为癌旁正常组织的（19.88±8.81）%，而7 例低分化肝癌患者的miR-126 相对表达量为癌旁正常组织的（9.15±4.76）%。

2.2 原位杂交法检测肝癌组织中miR-126 的表达

在本次实验的45 例肝癌患者的肝癌组织标本中的miR-126 在癌旁正常组织中的阳性表达率为80.00%（36/45），表达的主要位置定位于细胞浆；45 例肝癌患者的肝癌组织标本中的miR-126 在肝癌组织中的阳性表达率为31.11%（14/45）；其中具有高中分化肝癌13 例，低级分化肝癌1 例；两组表达数据差异具有统计学意义（P＜0.05）。相较于癌旁正常组织，肝癌组织的阳性着色程度明显较低。

2.3 细胞周期分析

根据流式细胞术结果：肝癌组织与癌旁正常组织细胞周期存在明显的差异，G1/G0期比例随着肝癌细胞中的S 期的增加而降低（P＜0.05）；肝癌组织miR-126 的阳性表达率与阴性表达率也具有显著差异，G1/G0期比例随着肝癌细胞中的S期的增加而降低（P＜0.05）。见表1。

3 讨论

细胞的生长是通过细胞周期来实现的，外部环境例如细胞因子与细胞表面的受体完全结合进而形成的级联式反应而对细胞生长起到促进作用[10-11]。并且，细胞内的原发癌基因也将对细胞的生长起到促进作用，两方面原因对细胞生长的促进作用都需要通过影响细胞周期来发挥作用。当前临床中将细胞全周期分为G1、S、G2以及M 期，其中G1向S 期过渡阶段以及G2向M 期的过渡与纺锤体组装阶段中，有几个重要的检验点对细胞周期的正常运行起到重要的调控作用，其中，G1/S 是控制细胞周期启动的关键调控点，它是决定细胞生长周期能否从G1期进入S 期的关键。目前临床中对于细胞周期的研究也及集中于G1/S 调控阶段[12-13]，近年来研究发现：miRNA 的表达失衡与多种肿瘤的发生联系紧密，miR-126 对于肝癌细胞的生长、应激反应、代谢、增殖与表达具有重要的调控作用，在正常肝细胞中，miR-126 能够正常表达，而对于肝癌细胞其表达水平较低[14-15]。结合本次实验结果：45 例肝癌患者的肝癌组织标本中的miR-126 相对表达量为癌旁正常组织的（17.73±9.21）%，在癌旁正常组织中的阳性表达率为80.00%（36/45）；38 例高中分化肝癌组织中的miR-126 相对表达量为癌旁正常组织的（19.88±8.81）%，而7 例低分化肝癌患者的miR-126 相对表达量为癌旁正常组织的（9.15±4.76）%；45 例肝癌患者的肝癌组织标本中的miR-126 在肝癌组织中的阳性表达率为31.11%（14/45）；其中具有高中分化肝癌13 例，低级分化肝癌1例；肝癌组织与癌旁正常组织细胞周期G1/G0期比例随着肝癌细胞中的S 期的增加而降低，（P＜0.05）；肝癌组织miR-126 的阳性表达率与阴性表达率也具有显著差异，G1/G0期比例随着肝癌细胞中的S 期的增加而降低，（P＜0.05）。

表1 肝癌组织与癌旁正常组织细胞周期分析（%，±s）

表1 肝癌组织与癌旁正常组织细胞周期分析（%，±s）

综上，miR-126 在肝癌组织中表达水平较低且随着肿瘤分化进程的下降而降低，该改变方式对肝癌细胞的分裂与增殖起到促进作用。