益肺宣肺降浊方对血管性痴呆大鼠海马神经元凋亡及p-CREB和CREB蛋白表达的影响

王清碧，唐 农，吴 林，蔡鑫昆，毕信亚，李天威，李海沅，赵清山

（1.广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011；2.广西中医药大学，广西 南宁 530200；3.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023；4.盐城市中医院，江苏 盐城 224001；5.马鞍山市中医院，安徽 马鞍山 243012）

血管性痴呆（vascular dementia，VD）是由各种脑血管病引起的获得性、持续性智能损害综合征，临床中最突出的表现是学习和记忆等认知功能的下降。在发达国家中VD占全部痴呆患者的25%～50%，成为导致痴呆的第二大原因［1］。在所有的痴呆类型中，从某种程度上讲，血管性痴呆是可以防治的［2］。伴随着医疗技术水平的提高以及老龄化社会的到来，血管性痴呆的发病率越来越高，一方面给老年患者的身心健康带来严重的危害，另一方面也给家庭和社会带来繁重的经济和精神负担，因此，预防和治疗血管性痴呆受到越来越多人的关注。本实验参照吕氏造模方法［3］，采用两侧颈总动脉夹闭再通法制备VD 模型，通过Tunel法检测神经细胞的凋亡，Western Blot检测VD大鼠海马CA1 区cAMP∕PKA-CREB 信号通路相关因子p-CREB 和CREB 的蛋白表达，观察益肺宣肺降浊方对血管性痴呆大鼠海马神经元凋亡及p-CREB 和CREB蛋白表达的影响。现将实验结果报道如下。

1 实验材料

1.1 动物 SPF 级SD 雄性大鼠190 只，体质量200±20 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，合格证号：43004700002251。

1.2 主要药品及试剂 益肺宣肺降浊方免煎颗粒（相当于含生药量：黄芪15 g、人参15 g、麦冬15 g、桔梗10 g、杏仁10 g、三七15 g、苏子15 g、石菖蒲15 g、酒大黄6 g），由广西中医药大学第一附属医院提供；石杉碱甲片（商品名“双益平”，国药准字H10960133，上海复旦复华药业有限公司）；p-CREB抗体（批号4276，美国Santa Cruz 公司）；CREB 抗体（批号4820，美国Santa Cruz 公司）；二抗（兔抗山羊，北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.3 主要器材 D700 型照相系统（日本NIKON）；BX60 型显微镜（OLYMPUS）；DW-86L490 型-80 ℃冰箱（青岛海尔特种电器有限公司）；BCD-268WBCS 型20 ℃冰箱（青岛海尔股份有限公司）；HYC-326A 型4 ℃冰箱（青岛海尔特种电器有限公司）；50121224 型离心机（THERMO FISHER 公司）；全自动石蜡切片机（德国MICRO）；转移脱色摇床（海门其林贝尔仪器制造公司）；电泳仪（北京百晶生物技术有限公司）；电热恒温水浴槽（上海医用恒温设备厂）。

2 实验方法

2.1 造模方法 参考文献［3］方法造模：动物于术前8 h 禁食，予10%水合氯醛3 ml∕kg 腹腔注射麻醉。所有的手术器械先高温灭菌，固定好大鼠，然后颈部去毛，碘伏消毒后，行颈正中切口，依次应用玻璃分针分离出双侧颈总动脉并用0 号丝线结扎，手术过程中注意不要牵拉迷走神经，阻断血流20 min，同时在大鼠距尾尖1 cm处断尾，放血约0.3 ml，然后松开丝线恢复大脑血流10 min，再次阻断血流20 min，如此重复3次，即3 次缺血20 min、再灌注10 min 的方式，造成VD模型。第3 次血流再灌注后，切口给予适量头孢粉末预防感染，随即行皮肤缝合，放回笼中正常饲养。空白组只分离双侧颈总动脉，不结扎也不阻断。

2.2 VD 模型筛选 造模10 天后进行VD 模型筛选，按照上述定位航行实验方法，参照赵宪林等［4］的VD大鼠模型筛选标准进行筛选，即以空白组大鼠逃避时间的均值为参考值，计算造模大鼠各时段成绩的平均逃避潜伏期与参考值之差占该鼠的平均逃避潜伏期时间的比例，该比例＞20%即可定为VD大鼠。

2.3 分组及给药 将造模成功大鼠随机分为中药高、中、低剂量组，石杉碱甲组，模型组，每组20 只。另取22 只作为空白组。在造模第20 天开始灌胃给药，给药量均按人与大鼠体表面积系数比确定，以临床人用药等效剂量作为中剂量。经过计算后，中药高、中、低剂量组大鼠的给药剂量分别为24.36 g∕（kg·d）、12.18 g∕（kg·d）、6.09 g∕（kg·d），石杉碱甲组给药剂量为0.15 mg∕（kg·d），所有药物均用双蒸水溶解，给药浓度按照上述的给药剂量折算至每天按10 ml∕kg大鼠体重灌胃。模型组和空白组给予相应体积（10 ml∕kg）的双蒸水。每天给药1次，30 d后制取标本。

2.4 指标检测

2.4.1 Tunel 法检测取材 行为学测试结束后，每组取6只大鼠，用10%的水合氯醛按0.3 g∕kg的用量腹腔注射麻醉，快速开胸暴露大鼠心脏，剪开右心耳，夹持心尖，将粗针头经左心室插入升主动脉，用动脉夹将针头固定。快速滴入37 ℃生理盐水100～250 ml 冲洗大鼠体内血液，直至右心耳处流出浅白色液体或液体基本澄清。随即灌注4 ℃4%多聚甲醛，先快速灌入约30 s，然后缓慢灌注，直至大鼠头部变硬，四肢震颤后停止灌注。然后立即断头取脑，分离出双侧海马放入4%多聚甲醛中固定。然后经脱水、浸蜡、包埋、连续冠状切片，片厚约5 μm，采用Tunel法检测海马区神经细胞调亡。

2.4.2 p-CREB 和CREB 的检测 行为学测试后，采取断头低温新鲜取脑，然后放入-80 ℃液氮中保存备用。取-80 ℃保存的新鲜组织提取总蛋白，用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度。每孔上样量为30 μg，电泳、转膜，于含5%脱脂奶粉的封闭液中封闭；置装有稀释好的一抗工作液的杂交袋中过夜，PBS洗膜3次，每次15 min；加二抗于室温孵育2 h后曝光，观察结果。

2.5 统计学处理 所有数据采用SPSS 17.0 统计软件进行分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，3 组以上计量资料比较用单因素方差分析，所有的统计检验均采用双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 Tunel荧光检测大鼠海马神经细胞凋亡情况 结果见图1及表1。

结果显示，神经元凋亡（Tunel 阳性细胞）以绿色荧光表示，空白组偶见阳性细胞，仅有少量细胞凋亡；模型组阳性细胞明显增多，簇拥成团状，跟空白组比较神经细胞凋亡数目明显增加（P＜0.01）；与模型组比较，各用药组神经细胞凋亡数目明显减少，有显著性差异（P＜0.01）；中药随着剂量的增加，其改善海马神经细胞凋亡的作用越明显，呈剂量正相关（P＜0.01），其中高剂量组与石杉碱甲组作用相当（P＞0.05）。

图1 各组神经元凋亡荧光染色图

表1 各组大鼠海马神经细胞凋亡数目（±s）

表1 各组大鼠海马神经细胞凋亡数目（±s）

注：与空白组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.01；与石杉碱甲组比较，③P＜0.01；与中药高剂量组比较，④P＜0.01

组别空白组模型组中药高剂量组中药中剂量组中药低剂量组石杉碱甲组n 6 6 6 6 6 6神经细胞凋亡数目19.16±11.58 118.33±31.41①③④26.66±10.32②49.16±11.58①②③④71.66±10.80①②③④30.00±14.14②

3.2 各组大鼠海马组织p-CREB与CREB蛋白含量比较 结果见图2、表2。

图2 各组大鼠海马组织p-CREB和CREB蛋白表达条带

表2 各组大鼠海马组织p-CREB和CREB蛋白的表达（±s）

表2 各组大鼠海马组织p-CREB和CREB蛋白的表达（±s）

注：与空白组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.01

组别空白组模型组中药高剂量组中药中剂量组中药低剂量组石杉碱甲组n 16 14 14 14 14 14 p-CREB蛋白表达0.849±0.172 0.334±0.038①0.771±0.133②0.596±0.082①②0.400±0.028①0.416±0.056①CREB蛋白表达0.886±0.143 0.195±0.024①0.834±0.162②0.619±0.015①②0.391±0.066①0.465±0.104①②

结果显示，与空白组比较，模型组p-CREB、CREB蛋白表达均明显下降（P＜0.01）；与模型组比较，中药高、中剂量组p-CREB、CREB 蛋白表达均明显升高（P＜0.01），其中中药高剂量组接近空白组水平（P＞0.05）；石杉碱甲组CREB 蛋白表达明显升高，与模型组比较有显著性差异（P＜0.01）。

4 讨 论

中医对血管性痴呆没有专门的论述，但是早在《黄帝内经》中已有关于痴呆症状的记载。《灵枢·天年》记载：“肺气衰，魄离，故言善误”，而“言善误”正是痴呆病的重要症状，在此为肺气虚，脑海失养所致。《素问·调经论》记载：“血并于下，气并于上，乱而喜忘。”气血相本来是相互结合，协调运行的，故此血瘀积蓄于下，气滞偏盛于上所致的“乱而喜忘”。《伤寒论》237 条记载：“阳明证，其人喜忘者，必有蓄……宜抵当汤下之。”“喜忘”属于记忆力障碍，痴呆病的另一重要特征便是记忆障碍。纵观血管性痴呆历年以来的研究成果，在病因病机的认识上，比较一致的看法是，其发病病位在脑，病机在脏腑气，属本虚标实证。本虚为脏腑亏损，气不足，尤与心肝脾肾亏虚关系密切；标实为痰阻、血瘀、浊毒。在上世纪90 年代，我校唐农教授提出了“脑病从肺论治”观点，本研究的益肺宣肺降浊方是依据“从肺论治痴呆”的观点拟定的经验方，前期临床实践已证实其具有良好的疗效［5-8］。痴呆固然与五脏中心、肝、脾、肾虚损关系甚大，但肺脏虚损在其发生发展过程中同样起着重要的作用。如心主神志，为君主之官，但肺朝百脉，为相傅之官，辅佐心君；肝木失去肺金正常克制可致肝阳上亢；肺虚无法为脾宣发津液可致脾虚湿困；肾属水主藏精，生髓，脑为髓海，而肺属金主“收”，生肾水。痴呆病的特征是记忆的不同程度丧失，而记忆的丧失实际上是肾的“藏纳”功能障碍，即收藏不利，直接影响到信息的存储；而肾之“藏”是以肺之“收”为前提条件的，肺是启动记忆存储过程的关键环节，标实为瘀、痰浊、浊毒。“瘀痰”的发生是气血津液运行失调的表现，“瘀”与肺的关系不待多言，肺朝百脉也。“痰浊”则主要与肺、脾、肾三脏功能直接相关，而“浊毒”则与“腑滞”相关。肺与大肠相表里，二者协调配合，共同完成气的宣降功能。老年人脏腑功能衰退，肺气不足，宣降失职，大肠传导失司，糟粕滞留肠腑，产生浊毒，清气不升，浊阴不降，上扰清窍，从而导致痴呆发生。因此，肺脏虚损在痴呆发生发展过程中是一个不可忽视的环节，在治疗痴呆这一疾病时，重视调理肺气具有重要的临床指导意义［9-13］。

石杉碱甲是从中药材中提取出来的天然植物碱，作为一种可逆性胆碱酶抑制剂，其具有提高认知功能、增强记忆保持和促进记忆再现的作用。本实验选择石杉碱甲作为阳性对照药物，以更好地观察益肺宣肺降浊方对血管性痴呆的治疗作用。本实验结果显示，模型组神经细胞凋亡明显，各中药组大鼠海马CA1 区神经细胞坏死、凋亡较模型组显著减轻，说明益肺宣肺降浊方对VD 大鼠海马神经元凋亡具有一定的保护和减缓作用，且中药在一定的剂量范围内，随着剂量的增加疗效更显著。

cAMP∕PKA-CREB 信号转导通路作为学习、记忆障碍的一个重要信号调节系统，在改善学习、记忆能力方面发挥着重要作用，其中，在cAMP∕PKA-CREB信号转导通路中，CREB 和p-CREB 蛋白的表达极其关键［14-16］，本实验结果表明，血管性痴呆大鼠应用益肺宣肺降浊方治疗后，可增加海马CA1 区p-CREB 和CREB 蛋白的表达，结合神经元凋亡实验结果，提示益肺宣肺降浊方可增强cAMP∕PKA-CREB 信号转导通路的作用，可用于改善血管性痴呆患者的临床症状。