同位素稀释-气相色谱-质谱联用法分析烟气中性香味成分

贾春晓，黄备备，杨鹏飞，陈芝飞，席高磊，毛多斌

(1.郑州轻工业学院材料与化学工程学院，河南 郑州 450002；2.郑州轻工业学院烟草科学与工程学院，河南 郑州 450002；3.河南中烟工业有限责任公司技术中心，河南 郑州 450000)

卷烟降焦会导致烟气中香气传输量减少，为突出卷烟的特征香韵，加香成为提高香烟产品质量的重要手段。加香或补香必须以烟气中的香味成分及其含量为基础[1]，所以分析测定烟气中香味成分，尤其是对香气有较大影响的中性成分含量具有重要意义。

目前，已有较多关于烟气香味成分的分离鉴定和半定量分析的报道[2-6]，但是存在样品前处理过程繁琐、定量分析误差较大等问题[7]。关于定量分析，有报道采用半制备高效液相色谱结合 GC/MS法测定某品牌成品卷烟烟气中性香味成分[8-9]，与直接采用 GC/MS法[10-11]相比，该方法在测定的中性香味成分数量，方法的灵敏度和准确度等方面均有提高，但某些痕量香味成分，如香叶基丙酮和β-紫罗兰酮等，在复杂的分离除杂过程中有损失，回收率较低，影响了这些关键致香成分含量的准确测定。由于烟气的化学成分复杂，受基质效应的制约，在可获得标记目标化合物的情况下，稳定同位素稀释分析 (SIDA) 是消除定量分析过程中基质效应影响最有效的方法[12]。SIDA 在食品和医药的成分测定中已有较多应用[13-18]，但同位素作为内标物，旨在排除基质效应、提高定量分析准确度，而同位素标记物在化合物定性分析方面的应用则少有报道。烟气中很多重要的香气成分在进行色谱分离时干扰严重，定性和定量分析均有较大难度。利用同位素分子离子及带同位素原子的特征碎片离子的标记作用，并配合标准品的保留时间进行定性分析，在此基础上，利用同位素内标校正基质效应对烟气中痕量香味成分进行定量分析，将大大提高定性分析的可靠性和定量分析的准确性。

本研究拟采用同时蒸馏萃取法提取烟气中性香味成分，应用 SIDA 技术结合 GC/MS 法对烟气中的 10 种关键痕量中性香味成分进行定性和定量分析，旨在为复杂基质中痕量成分的定性和定量分析提供方法参考。

1 实验部分

1.1 材料、试剂与仪器

市售成品卷烟，编号为 1～4；单料卷烟，编号为 5～16；黄金叶某品牌成品卷烟。各品种卷烟烟支长度均为84 mm，由河南中烟工业有限责任公司提供；进口剑桥滤片，Φ=92 mm。

二氯甲烷(色谱纯)、36%盐酸、氢氧化钠(分析纯)：均为天津市凯通公司产品；无水硫酸钠(分析纯)：烟台市双双化工有限公司产品。

苯甲醛(编号1#，纯度99%)、6-甲基-5-庚烯-2-酮(编号2#，纯度98%)、乙酸糠酯(编号3#，纯度99%)、苯甲酸甲酯(编号4#，纯度99%)、异氟尔酮(编号5#，纯度97%)、2,4-二甲基苯乙酮(编号6#，纯度95%)、2-十一酮(编号7#，纯度98%)、香叶基丙酮(编号8#，纯度98%)、β-紫罗兰酮(编号9#，纯度95%)和苯甲酸苄酯(编号10#，纯度99%)标准品：均为百灵威科技有限公司产品。

D5-苯甲醛(编号1′#，纯度99%)、D8-异氟尔酮(编号5′#，纯度98%)稳定同位素标记物：均为美国Sigma公司产品；13C3-6-甲基-5-庚烯-2-酮(编号2′#，纯度95%)、D3-乙酸糠酯(编号3′#，纯度99%)、D5-苯甲酸甲酯(编号4′#，纯度99%)、D3-2,4-二甲基苯乙酮(编号6′#，纯度98%)、13C3-2-十一酮(编号7′#，纯度99%)、13C3-香叶基丙酮(编号8′#，纯度95%)、D4-β-紫罗兰酮(编号9′#，纯度95%)和D5-苯甲酸苄酯(编号10′#，纯度99%)稳定同位素标记物：均由本实验室通过化合制得，纯度经HPLC法检测，结构经红外光谱、核磁共振谱、多级质谱及高分辨质谱确证。

RM20H转盘式自动吸烟机：德国Borgwaldtkc公司产品；WB-2000旋转蒸发仪：郑州长城科工贸有限公司产品；GC 7890-MS 5977 B型气相色谱-质谱联用仪：美国Agilent公司产品；电子天平(感量0.000 01 g)：瑞士梅特勒-托利多公司产品；同时蒸馏萃取仪：上海华科公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1标准溶液的配制 分别准确称取23.01、17.10、14.21、14.17、13.92、17.05、18.30、19.51、12.53、34.14 mg编号为1#～10#的化合物于100 mL容量瓶中，用二氯甲烷溶解、定容，配制成10种香味化合物的混合标准储备液(计算化合物浓度时，称取量用各自纯度进行校正)，于2～4 ℃保存，备用。

相应的10种同位素标记物混标储备液的制备：分别准确称取20.97、10.29、16.14、5.24、8.92、14.23、8.17、15.25、9.53、16.86 mg编号为1′#～10′#的同位素标记物于100 mL容量瓶中，用二氯甲烷溶解、定容，配制成相应的10种同位素标记物混合标准储备液(计算化合物浓度时，称取量用各自纯度进行校正)，于2～4 ℃保存，备用。

10种香味化合物混合标准工作液的制备：分别准确移取0.01、0.05、0.10、0.15、0.50、1.50、2.50、5.00 mL 10种香味化合物混标储备液于10 mL容量瓶中，再分别加入1.00 mL 10种目标化合物的稳定同位素标记物混标储备液，用二氯甲烷定容，配制成不同浓度系列的混合标准工作液，待测。

1.2.2样品前处理 按照国家标准GB/T 19609—2004在RM 20H转盘式自动吸烟机上对20支卷烟进行抽吸，采用剑桥滤片捕集卷烟主流烟气总粒相物(TPM)。抽吸完毕后，采用同时蒸馏萃取法，以二氯甲烷为萃取剂萃取剑桥滤片上捕集的TPM中的香味成分，得到二氯甲烷萃取液。然后,分别用5%盐酸溶液(体积百分比，下同)和5%氢氧化钠溶液洗涤,除去萃取液中的碱性和酸性成分，得到中性香气成分萃取液。向萃取液中加入无水硫酸钠，冷藏、干燥、过夜，并浓缩至1.0 mL，得到中性成分浓缩液，待测。与文献[8]的样品前处理方法相比，该方法不需要用半制备HPLC将其分离为3个馏分，可以直接进行GC/MS分析，样品用量由200支卷烟减少到20支卷烟，缩短了分析时间，简便易行。

1.3 实验条件

1.3.1色谱条件 色谱柱：HP-5 MS毛细管柱(60 m×250 μm×0.25 μm)；载气：高纯氦气，纯度为99.999%，流速1.0 mL/min；进样口温度280 ℃；不分流进样；进样量1 μL。升温程序：初始温度50 ℃，保持4 min；以1 ℃/min升至57 ℃，保持6 min；以2 ℃/min升至72 ℃，保持7 min；以1 ℃/min升至84 ℃，保持6 min；以1 ℃/min升至90 ℃，保持5 min；以3 ℃/min升至110 ℃，再以1 ℃/min升至120 ℃，保持3 min；以3 ℃/min升至147 ℃，保持3 min；以2 ℃/min升至163 ℃，保持5 min；以4 ℃/min升至240 ℃。

1.3.2质谱条件 定性和定量分析时分别选择全扫描(SCAN)和选择离子监测(SIM)模式；电子轰击(EI)源温度280 ℃，接口温度280 ℃，四极杆温度150 ℃，电子倍增器电压2.28 kV，质量扫描范围m/z35～500，溶剂延迟时间8 min。各化合物的定性和定量离子列于表1。

表1 10种香味化合物及其相应同位素标记物的定性和定量离子Table 1 Qualitative and quantitative ions of 10 aromatic components and respective isotope markers

2 结果与讨论

2.1 GC/MS条件的优化

本研究旨在对定量分析中回收率较低的痕量中性香味成分的含量进行准确测定。回收率低的主要原因是样品前处理过程复杂、基质效应影响较大，本研究在文献[8]的基础上，选择10种回收率较低的痕量中性香味成分，简化样品前处理过程，使中性待测液不经过半制备HPLC分离，直接采用GC/MS法分离分析，同时也减少了卷烟样品的用量。由于烟气中性成分复杂，本研究进一步优化了GC/MS分析条件，对色谱柱和升温速率进行考察，最终确定了1.3节的实验条件，该条件下，各目标化合物与干扰成分之间可得到基本分离。

2.2 10种目标化合物的定性分析和定性定量离子的选择

由于采用了稳定同位素稀释分析技术，同位素内标的加入不仅可以消除定量分析过程中的基质效应，还可以对目标化合物的定性检出起到标记作用，使各痕量成分在前处理步骤简化、干扰严重的情况下，利用同位素的分子离子峰和特征碎片离子峰，以及标准化合物的保留时间进行定性分析。

以样品中苯甲醛的鉴定为例，按1.3节的实验条件对D5-苯甲醛和苯甲醛标准溶液进行分析，其保留时间分别为25.52 min和25.34 min，总离子流色谱图示于图1a、1b；在相同条件下对烟气中性成分萃取液进行GC/MS分析，局部的总离子流图示于图1c。根据对照标准品的保留时间可以初步确定图1c中的峰1是苯甲醛+D5-苯甲醛，由于两者结构和性质非常相近，所以不能达到基线分离。目标化合物苯甲醛与干扰成分不能完全分离，利用数据库检索时匹配度较低。在此情况下，从峰1中提取质谱图(保留时间为25.34 min)，示于图2。图2中包含了D5-苯甲醛和苯甲醛的分子离子峰和特征碎片峰，如D5-苯甲醛的分子离子峰(m/z111)以及特征离子峰m/z110、82、54和52等，这些离子中都包含了同位素原子；而苯甲醛相应的离子峰分别是m/z106、105、77、51和50，其中，苯甲醛的裂解途径示于图3，由此可进一步确证峰1是苯甲醛+D5-苯甲醛。

注：a.D5-苯甲醛；b.苯甲醛；c.中性成分萃取液图1 D5-苯甲醛(a)、苯甲醛(b)和局部(c)的总离子流色谱图Fig.1 Partial total ion chromatogram of D5-benzaldehyde (a), benzaldehyde (b) and the neutral component extract (c)

图2 图1c中保留时间为25.34 min时提取的质谱图Fig.2 Mass spectrum extracted at 25.34 min in Fig.1c

此外，通过计算可知峰1中保留时间为25.34 min的组分，比较质谱图中的特征碎片离子(m/z105、77、5、50)与分子离子(m/z106)的丰度比和苯甲醛标准溶液的相同离子与分子离子的丰度比，相对误差在欧盟EC/657标准允许范围之内，即峰1中保留时间为25.34 min的组分为苯甲醛。其他目标化合物的定性分析过程与之相同。由此可知，尽管本研究省去了半制备HPLC分离步骤，但对于样品基质复杂，目标化合物定性分析干扰严重时，可以通过同位素的标记作用，利用同位素标记物相应的质谱数据，再结合标准品的保留时间和各碎片离子与分子离子的丰度比鉴定各目标化合物。该方法简便可靠，能有效排除同分异构体等成分的干扰。

选择带有同位素原子的特征碎片离子作为各目标化合物的定性离子，其中以信噪比高、干扰小的离子对作为定量离子。为使分析方法的选择性和灵敏度均较高，每个化合物选择2个定量离子，数据列于表1。在SIM模式下，选择表1中的定量离子分别对10种化合物混标溶液、相应的10种同位素标记物混标溶液和中性成分萃取液进行GC/MS分析，其选择离子流色谱图(片段图)示于图4、图5(图中峰的编号与1.1节中化合物编号相同)。由图5可知，通过选择离子，萃取液中各目标化合物与干扰成分达到基线分离，可进行准确的定量分析。

图3 苯甲醛分子的裂解途径Fig.3 Fragmentation pathways of benzaldehyde molecule

图4 10种化合物混标溶液和相应的10种同位素标记物混标溶液的选择离子流片段图Fig.4 Fragments of selected ion chromatogram of 10 compounds mixing standard solution and the respective 10 isotope markers mixing standard solution

图5 加入10种同位素标记物的中性成分萃取液的选择离子流片段图Fig.5 Fragments of selected ion chromatogram of the neutral components extract added 10 isotope markers

2.3 线性范围、检出限和定量限

对1.2.1节配制的10种香味化合物混合标准工作液，按1.3节条件分析，以各化合物的峰面积与其相应的稳定同位素标记物的峰面积比为纵坐标，化合物浓度为横坐标，绘制标准曲线。分别以信噪比S/N=3和S/N=10计算方法的检出限和定量限，其线性范围、相关系数、检出限和定量限列于表2。

2.4 回收率实验及与文献方法的对比

本研究选择的10种痕量中性香味成分在文献[8]的测定中回收率均偏低，为了与之对比，选择在相同品牌卷烟中添加一定量的各标准化合物，测定各自的样品加标回收率。在截留主流烟气总粒相物的剑桥滤片上加入10种香味化合物的标准品，加标量(用各化合物纯度校正后的质量)列于表3。按1.2.2节方法处理，然后按1.3节条件分析，平行测定5次，计算卷烟样品中各目标化合物加标后的平均总含量。将不加标样品平行测定5 次，用表2中的线性方程计算原含量、平均回收率和相对标准偏差(RSD)，考察方法的准确度和精密度，结果列于表3。

表2 10种化合物的线性方程、线性范围、相关系数、检出限和定量限Table 2 Linear equations, linear ranges, correlation coefficients, limits of detection and limits of quantification of 10 compounds

表3 回收率与精密度测定结果(n=5)Table 3 Results of recovery and precision (n=5)

由表3可以看出，所测卷烟烟气中10种香味化合物的平均回收率在83.3%～106.6%之间，RSD在0.15%～8.69%之间，说明该方法准确度和精密度较好。

本实验与文献[8]中该10种化合物的回收率测定方法均为样品加标回收率，具有可比性。由表3可以看出，本实验测得的10种香味化合物的回收率与文献[8]相比有较大提高。该结果表明，本实验样品前处理步骤简单，可以有效降低痕量成分的含量损失；加入的同位素标记物在提取效率、净化过程中的损失、共存成分的影响等方面与被测物基本一致，能有效校正实验中的基质效应，消除样品在前处理步骤中含量损失带来的影响，使测得的含量值更接近真实值，从而提高回收率。与文献[8]相比，本实验测得的10种香味化合物含量均有所提高，但含量的相对高低保持一致，如含量较高的成分均为香叶基丙酮和苯甲酸苄酯。

2.5 实际样品的测定

用本方法对4种不同品牌成品卷烟(编号为1～4)和12种单料卷烟(编号为5～16)中10种中性香味成分的含量进行测定，结果列于表4。由表4可知，其中，香叶基丙酮、β-紫罗兰酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2,4-二甲基苯乙酮和2-十一酮在成品卷烟中的含量均比在单料烟中高；苯甲醛、苯甲酸甲酯、异氟尔酮的含量在两类卷烟中含量相差不大；乙酸糠酯、苯甲酸苄酯在成品卷烟中的含量均比在单料烟中低。本方法对各香味成分的含量测定更准确，可以作为卷烟补香和加香的重要依据。

表4 16种卷烟样品烟气中10种香味化合物的含量Table 4 Contents of 10 aromatic components in smoke of 16 kinds of cigarette samples

3 结论

建立了同位素稀释-气相色谱-质谱联用法分析烟气中10种痕量中性香味成分的方法。在前期研究的基础上，简化了样品的前处理步骤，减少了样品用量。通过对GC/MS分析条件的优化和对各化合物质谱裂解规律的研究，利用同位素标记物的分子离子、特征碎片和标准品的保留时间等信息，使样品中各目标化合物在复杂基质中得到准确的定性分析；同时，同位素内标的加入有效地降低了基质效应，提高了回收率。在SIM模式下对样品进行GC/MS分析，待测目标化合物与干扰成分得到完全分离，可满足定量分析的要求。本研究所建立的定量分析方法对10种化合物的线性关系良好，相关系数r均大于0.999 0，方法的检出限为0.34～4.59 μg/kg，定量限为1.14～15.30 μg/kg，远低于各成分的含量，方法灵敏度较高。各化合物的平均回收率在83.3%～106.6%之间，RSD在0.15%～8.69%之间，可见该方法的准确度高、重复性好。在可获得稳定同位素的基础上，利用该方法可以测定更多烟气中痕量香味成分的含量，研究结果对卷烟主流烟气中性香味成分含量的测定及指导卷烟加香加料具有重要意义。