手足口病患儿细胞免疫功能与相关细胞因子水平变化的临床研究

陈星，戢敏，喻雪琴，陈芳，梅怡晗，梅小平

（1.川北医学院附属医院 感染科，四川 南充 637000；2.首都医科大学，北京 100069）

手足口病（hand foot and mouth disease, HFMD）是儿科的一种常见传染病，主要由肠道病毒感染所致，具有传染性强、传播快的临床特点。绝大多数患儿病情呈自限性发展，少数患儿可发展至重型HFMD。多数学者认为，HFMD的发生机制与细胞免疫功能异常和相关细胞因子水平失衡相关[1-3]。笔者就HFMD患儿循环血T巴细胞亚群、NK细胞、白细胞介素-10（Interleukin-10, IL-10）、白细胞介素-17（Interleukin-10, IL-17）及肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis facto, TNF-α）表达水平的变化进行临床研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2016年1月—2018年6月川北医学院附属医院就诊的68例HFMD患儿作为观察组。其中，男性42例，女性26例；年龄（3.12±1.28）岁；根据临床病情程度：普通型42例，重症型26例。HFMD诊断符合2010年国家卫计委办公厅颁布的《手足口病诊疗指南》中的诊断标准及分型[4]。随机选取同期门诊健康体检的25例儿童作为对照组。其中，男性17例，女性8例；年龄（3.27±1.21）岁。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 方法

收集HFMD患儿循环静脉血标本、年龄、性别、病史、症状、体征及辅助检查等临床资料；同时检测HFMD患儿、对照组儿童的循环静脉血病原学、T淋巴细胞亚群、NK细胞、IL-10、IL-17及TNF-α的表达水平。

1.3 标本采集

观察组在入院隔日清晨、对照组儿童在体检时清晨抽取循环血标本2 ml置于EDTA抗凝的试管内，循环静脉血标本离心后血清在≤-20℃低温冷冻保藏，血清检测采用中和抗体测定法。具体检测方法依据卫生部《全国临床检验操作规程》[5]。

1.4 病毒学检测

采用美国ABi公司的ABI7300荧光定量PCR仪和江苏默乐生物科技有限公司生产的EV71、CoxA16及通用型肠道病毒核酸检测试剂盒，运用实时荧光定量聚合酶链反应方法检测EV、肠道病毒71（Enterovirus-71, EV-71）及CA16等肠道病毒RNA，严格按照说明书由专人进行操作。

1.5 循环血T细胞亚群检测

以美国BD公司生产的FACS Calibur流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群，取观察组与对照组的循环静脉血2 ml EDTA-K2抗凝。在各试管中加入10μl由CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC和CD3-FITC/CD16+CD56-PE/CD45-PerCP/CD19-APC组成的4标记单克隆抗体，同时加入100μl抗凝循环静脉血混匀并标记30 min，加入固定剂30μl固定5～10 min；加入红细胞溶解液1 ml溶解红细胞10～20 min，最后加磷酸盐缓冲液后用流式细胞仪计数10 000个淋巴细胞并进行分检。

1.6 循环血清细胞因子IL-10、IL-17及TNF-α水平检测

采集观察组和对照组循环静脉血2 ml，离心后留取血清在≤-20℃低温冷冻保藏，采用美国ADLD公司试剂盒及Rayto RT-6100型酶标仪，酶联免疫法检测血清IL-10、IL-17及TNF-α水平。

1.7 治疗后T细胞亚群及炎症因子的检测

入院治疗后第7天清晨再次抽取循环静脉血标本2 ml置于含EDTA抗凝的试管内，循环静脉血标本离心后血清在≤-20℃低温冷冻保藏，其T细胞亚群及血清细胞因子IL-10、IL-17及TNF-α的检测方法、试剂与检测人员等与入院初次检测一致。

1.8 统计学方法

数据分析采用SPSS 13.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验或配对t检验；计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较

两组性别、年龄比较，经t检验或χ2检验，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 两组一般资料比较

2.2 HFMD肠道病毒感染分布及构成比分析

68例HFMD患儿肠道病毒感染以单一病毒最为常见；其中EV-71构成比最高，EV-71+CA16构成比位居第2位。所有病毒感染后的RNA检测为阳性。见表2。

表2 HFMD患儿肠道病毒感染分布及构成比

2.3 两组治疗前细胞免疫功能及相应细胞因子水平

两组治疗前CD4+T、CD8+T及NK细胞水平比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05）；观察组CD4+T、CD8+T及NK细胞水平低于对照组（P＜0.05）。两组治疗前IL-10、IL-17及TNF-α水平比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05）；观察组IL-10、IL-17及TNF-α水平高于对照组（P＜0.05）。见表3。

2.4 不同病情程度HFMD患儿细胞免疫功能及相应细胞因子水平

重型HFMD组与普通型HFMD组治疗前CD4+T、CD8+T及NK细胞水平比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05）；重型HFMD组CD4+T、CD8+T水平低于普通型HFMD组，而NK细胞水平高于普通型HFMD组（P＜0.05）。重型HFMD组与普通型HFMD组IL-10、IL-17及TNF-α水平比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），重型HFMD组IL-10、IL-17及 TNF-α 高 于 普 通 型 HFMD 组（P＜0.05）。见表4。

2.5 观察组治疗前后循环血细胞免疫功能及相应细胞因子水平变化

观察组治疗7 d后与治疗前CD4+T、CD8+T、NK细胞水平比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗后CD4+T、CD8+T及NK细胞水平较治疗前高（P＜0.05）。观察组治疗 7 d 后与治疗前的IL-10、IL-17及TNF-α水平比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗后的IL-10、IL-17济 TNF-α水平较治疗前低（P＜0.05）。见表5。

表3 两组治疗前细胞免疫功能及相应细胞因子水平比较 （±s）

表3 两组治疗前细胞免疫功能及相应细胞因子水平比较 （±s）

组别 n CD4+T/% CD8+T/% NK 细胞 /% IL-10/（pg/ml） IL-17/（pg/ml） TNF-α/（pg/ml）对照组 25 40.551±1.282 22.570±3.322 9.692±1.232 25.352±1.784 26.253±1.771 1.874±0.223观察组 68 34.542±2.363 17.522±2.091 8.463±1.554 33.764±4.143 35.854±3.933 3.473±0.504 t值 16.323 8.223 3.614 13.132 15.501 20.543 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表4 不同病情程度HFMD患儿细胞免疫功能及相应细胞因子水平比较 （±s）

表4 不同病情程度HFMD患儿细胞免疫功能及相应细胞因子水平比较 （±s）

组别 n CD4+T/% CD8+T/% NK细胞/% IL-10/（pg/ml） IL-17/（pg/ml） TNF-α/（pg/ml）普通型HFMD组 42 45.124±1.734 26.014±1.234 3.154±0.253 30.881±1.972 33.243±2.401 3.133±0.284重型 HFMD 组 26 20.081±1.323 20.454±2.243 18.423±1.684 38.422±1.724 40.082±1.353 4.033±0.154 t值 63.232 11.553 46.094 16.093 15.023 17.092 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表5 观察组治疗前后循环血细胞免疫功能及相应细胞因子水平变化 （n =68，±s）

表5 观察组治疗前后循环血细胞免疫功能及相应细胞因子水平变化 （n =68，±s）

时间 CD4+T/% CD8+T/% NK细胞/% IL-10/（pg/ml） IL-17/（pg/ml） TNF-α/（pg/ml）治疗前 34.542±2.358 17.502±2.091 8.462±1.545 33.763±4.143 35.852±3.931 3.473±0.502治疗后 37.382±1.683 22.471±3.320 9.572±1.733 27.622±2.174 28.724±1.991 1.853±0.192 t值 8.062 10.441 3.962 11.294 13.334 25.002 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

3 讨论

HFMD是儿童中常见的一种传染性疾病，临床以发热、手掌、足、臀及口腔等多部位皮疹为特征，其主要由EV71、CA16等20多种人肠道病毒感染所致。近5年来，在中国乃至全世界EV-71型肠道病毒已成为最常见的HFMD病原体。EV-71感染后，HFMD患儿可呈现自限性痊愈，重症化时常出现肺部感染、心肺功能衰竭甚至死亡[6-8]。为此，探索HFMD的发病机制显得尤其重要。分析68例HFMD患儿后笔者发现，以单一EV-71感染最为常见；其次为EV-71+CA16的混合感染，这与朱其荣等[9]报道相一致。

目前，HFMD的发病机制不详，有学者认为，可能与患儿在感染EV-71、CA16等后机体出现免疫功能失衡与紊乱相关[10]。机体细胞免疫调控作用可通过CD8+T淋巴细胞直接杀伤病毒，也可通过CD4+T淋巴细胞活化B淋巴细胞来增强体液免疫反应来抑制病毒。CD4+T、CD8+T及NK细胞在机体免疫调控中发挥重要作用。研究显示，观察组患儿治疗前CD4+T、CD8+T及NK细胞水平较对照组低，表明EV-71感染后，HFMD患儿出现细胞免疫功能紊乱，大量的CD4+T、CD8+T淋巴细胞发挥抗病毒效应后通过Fas/FasL通路来诱导免疫细胞出现了程序性凋亡[11-12]。随着HFMD患儿病情加重，重型HFMD患儿CD4+T、CD8+T细胞水平较普通型HFMD下调明显，表明在HFMD重症化时，免疫细胞活化，大量免疫细胞耗竭；CD4+T、CD8+T表达频率下调，病毒的清除能力下降，导致疾病重症化，这与符青松等[13]和BENNETT等[10]研究结果一致。

有研究显示，患儿感染EV-71后，机体会释放各种细胞因子来诱导机体特异性或非特异性炎症的发生，同时对病毒发挥清除与抑制作用，最大限度地促进疾病痊愈[14]。在机体免疫功能低下时，大量促炎症因子释放诱导组织损伤，导致疾病重症化。本研究显示，观察组患儿IL-10、IL-17及TNF-α表达水平较对照组上调，表明HFMD患儿在感染EV-71等病毒后，活化的T淋巴细胞释放大量IL-17、TNF-α等促炎症因子，机体通过免疫反应抗病毒的同时也导致炎症反应的发生，这与李宏波等[15]结果一致。IL-10是抑炎因子代表，能抑制机体促炎因子的释放，减轻细胞氧化反应，抑制T细胞活化增殖。本结果显示，观察组抑炎因子IL-10较对照组升高，表明HFMD患儿被EV-71感染后，机体为减轻自我损伤会同时释放抑炎因子来维持促炎因子与抑炎因子的平衡。一旦促炎性因子与抑炎因子比例失衡时，可能会导致HFMD重症化，这与孙林春[11]的研究结果相似。经过治疗，在病程第7天观察组CD4+T、CD8+T及NK细胞水平较治疗前高，而IL-10、IL-17及TNF-α水平较治疗前低，表明HFMD患儿在病情好转时，T淋巴细胞可回升至常态，细胞免疫功能由紊乱趋向平衡；同时抑制IL-10、IL-17及TNF-α下降，纠正机体免疫紊乱与细胞因子水平的失衡状态。

综上所述，患儿免疫功能紊乱与细胞因子水平失衡在HFMD的发病机制中可能发挥关键作用，但确切的HFMD发病机制有待进一步研究[16-17]。因此，通过上述指标检测对手足口病的病情及预后判断可能有一定的指导作用。