TGF-β通过Lnc-ATB促进食管癌细胞侵袭转移的机制研究

鲁之中，李军民，胡云芝，李晓辉，李卫，姜富国，李帅，刘学庆

（焦作市人民医院 1.检验科，2.儿科，3.肿瘤外科，河南 焦作 454002；4.重庆医科大学 公共卫生与管理学院，重庆 400016）

食管癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，对健康危害极大[1]。随着医学及生命科学的发展，食管癌发病机制及治疗靶点的研究已成为医学研究领域的热点。转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）是一组新发现的可调节细胞生长及分化的TGF超家族，其在肿瘤细胞的上皮间质转化过程中发挥至关重要的作用[2-3]。然而在食管癌细胞中TGF-β所发挥的作用及机制目前仍不完全清楚。本研究拟深入探讨TGF-β在食管癌的功能及机制，为进一步揭示食管癌转移的分子机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

食管癌细胞系EC9706（中国科学院上海细胞库），RNA逆转录试剂盒（日本TaKaRa公司），Lnc-ATB siRNA及对照（广州锐博科技有限公司），Trizol裂解液（美国Sigma公司），TGF-β（深圳百恩维生物科技有限公司）；LipofectamineTM2000转染试剂（美国Invitrogen公司），Transwell小室（德国Millipore公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和转染用含10% Gibco胎牛血清的DMEM培养液培养食管癌细胞系EC9706，温度为37℃，二氧化碳CO2浓度为5%，置于培养箱中培养。当细胞培养至70%左右的融合度后，将5μl Lnc-ATB-siRNA及Lnc-ATB对照经250μl LipofectamineTM2000转入EC9706细胞中，将转染后的EC9706细胞分为Lnc-ATB-siRNA组及Lnc-ATB-NC组。

1.2.2 Lnc-ATB表达水平检测待食管癌细胞加入10 ng/ml TGF-β，将给予TGF-β处理的细胞作为TGF-β组，未给予TGF-β处理的细胞作为对照组。48 h后，收集两组细胞，用Trizol裂解细胞，分别提取细胞总RNA，逆转录为cDNA作为模板。实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative realtime polymerase chain reaction, qRT-PCR）的反应条件为：95℃预变性3 min，95℃变性15 s，59℃退火35 s，共进行39个循环，实验重复3次。Lnc-ATB正向引物 ：5’-TCTGGCTGAGGCTGGTTGAC-3’，反向引物 ：5’-ACACAGAATAAAATAACAC-3’；内参照甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）正向引物：5’-GGTGAAGGTCGGAGTCAACGG-3’，反向引物：5’-GAGGTCAATGAAGGGGTCATTG-3’。

1.2.3 EC9706细胞侵袭转移能力检测EC9706细胞不给予任何处理作为空白组；转染Lnc-ATB-siRNA作为Lnc-ATB-siRNA组；给予10 ng/ml TGF-β处理并转染Lnc-ATB-NC作为TGF-β+Lnc-ATB-NC组；给予10 ng/ml TGF-β处理并转染Lnc-ATB-siRNA作为TGF-β+Lnc-ATB-siRNA组。48 h后用胰酶消化各组细胞，磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）冲洗2遍，用含10%牛胎血清蛋白的无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度至2×105个/ml，取两组细胞悬液各150μl，加入已预先用Matrigel包被基底膜的Transwell小室。下室加入含10%胎牛血清的完全培养基600μl，培养48 h。而后取出小室，PBS冲洗2次，用棉签小心擦去微孔膜内层的细胞，95%乙醇固定两组细胞5 min，用1%结晶紫溶液着色，PBS洗涤2次，倒置显微镜下分别计数，每个样本随机计数10个视野。检测细胞转移步骤与细胞侵袭基本相同，区别在于细胞转移Transwell小室预先不包被Matrigel基底膜。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0统计学软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验或方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TGF-β上调食管癌EC9706细胞中Lnc-ATB的表达

TGF-β处理食管癌EC9706细胞48 h后，分别提取TGF-β组和对照组细胞的总RNA，均逆转录为cDNA，用qRT-PCR检测各组间Lnc-ATB的表达，TGF-β组Lnc-ATB的相对表达量为（1.000±0.062），对照组为（0.417±0.084），经t检验，差异有统计学意义（t=6.431，P=0.007），TGF-β组较对照组高。而后应用qRT-PCR检测Lnc-ATB siRNA在EC9706细胞中的干涉效果，结果显示Lnc-ATB-siRNA组EC9706细胞中Lnc-ATB相对表达量为（0.438±0.073），Lnc-ATB-NC 组为（1.000±0.082），经t检验，差异有统计学意义（t=4.392，P=0.021），Lnc-ATB-siRNA组较Lnc-ATB-NC组低，Lnc-ATB siRNA可有效沉默EC9706细胞中Lnc-ATB的表达。见图1。

图1 各组EC9706细胞中Lnc-ATB的相对表达量比较 （±s）

2.2 TGF-β组与对照组TGF-β处理后EC9706细胞的侵袭、转移能力比较

TGF-β处理食管癌EC9706细胞48 h后，TGF-β组侵袭细胞数为（98.328±11.033）个，对照组为（64.238±7.431）个，经t检验，差异有统计学意义（t=3.542，P=0.032）；TGF-β组转移细胞数为（45.759±15.561）个，对照组为（27.752±13.453）个，经t检验，差异有统计学意义（t=4.142，P=0.023），TGF-β组侵袭和转移细胞数均高于对照组，提示TGF-β可促进EC9706细胞的侵袭与转移能力。见图2、3。

图2 TGF-β组与对照组TGF-β处理后EC9706细胞的侵袭能力比较 （×200）

图3 TGF-β组与对照组TGF-β处理后EC9706细胞的转移能力比较 （×200）

2.3 各组TGF-β通过Lnc-ATB促进EC9706细胞侵袭、转移能力比较

空白组侵袭细胞数为（48.492±11.325）个，Lnc-ATB-siRNA组 为（22.328±8.925） 个，TGF-β+Lnc-ATB-NC组为（74.284±14.925） 个，TGF-β+Lnc-ATB-siRNA组为（37.827±5.329）个，经方差分析，差异有统计学意义（F=10.324，P=0.014）；空白组转移细胞数为（39.728±9.645）个，Lnc-ATB-siRNA组为（19.658±7.371）个，TGF-β+Lnc-ATB-NC组 为（51.462±3.627） 个，TGF-β+Lnc-ATB-siRNA组为（29.527±8.359）个，经方差分析，差异有统计学意义（F=8.792，P=0.026）。TGF-β+Lnc-ATB-NC组细胞侵袭及转移能力高于其他组（P＜0.05）；空白组细胞侵袭及转移能力高于TGF-β+Lnc-ATB-siRNA组 与 Lnc-ATB-siRNA组（P＜0.05）；TGF-β+Lnc-ATB-siRNA组与Lnc-ATB-siRNA组细胞侵袭及转移能力比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图4～7。

图4 各组TGF-β通过Lnc-ATB上调EC9706细胞侵袭能力 （×200）

图5 各组TGF-β通过Lnc-ATB上调EC9706细胞转移能力 （×200）

图6 各组TGF-β通过Lnc-ATB上调EC9706细胞侵袭能力比较 （±s）

图7 各组TGF-β通过Lnc-ATB上调EC9706细胞转移能力比较 （±s）

3 讨论

TGF-β作为生长因子对细胞分化、细胞增殖起关键调控作用，在多种癌症发生、发展过程发挥重要作用[4]。既往有研究报道，TGF-β在食管癌中异常高表达，其表达与食管癌的分期、分级密切相关，肿瘤分化程度越低，TGF-β的表达越强[5]。更有研究显示，食管癌中TGF-β下游效应分子SMAD4表达水平降低，其表达与肿瘤的临床病理分期及浸润深度呈负相关[6]。本研究同样显示，给予TGF-β后，食管癌细胞的侵袭及转移能力明显增强。由此可见，TGF-β在食管癌的发生、发展中发挥着重要作用。有大量报道试图阐明TGF-β在肿瘤中的作用机制，比如PASCHE[7]认为TGF-β由基质及肿瘤细胞产生后，在肿瘤微环境中可发挥肿瘤促进因子的作用，通过刺激肿瘤新生血管的生成，发挥免疫抑制及合成细胞外基质等作用，从而促进肿瘤细胞的增殖、转移及侵袭。但这些研究并不能为TGF-β在食管癌中的作用提供更精确的分子机制。

TGF-β是一个被广泛研究的细胞因子，恶性肿瘤会释放大量TGF-β帮助癌细胞快速分裂，同时借助Treg抑制免疫细胞对癌细胞的杀伤力[8]。但是由于正常细胞不能缺少TGF-β，因此很难设计靶向的方法来治疗癌症。科学家需要进一步探索TGF-β的分子机制，从其上下游作用的关键分子着手，研究相应的治疗靶点，这也是本研究的目的所在。

长链非编码RNA是近年来发现的一类转录本，其＞200个核苷酸，不具有蛋白编码潜能。许多研究表明，LncRNA经常在各种疾病中失调，在广泛的生物过程中有多种功能，如调控细胞增殖、凋亡及迁移等[9-10]。有文献报道，TGF-β可以激活部分长链非编码RNA的表达及功能[11-12]。YUAN等[13]利用LncRNA芯片，结合经典分子生物学技术，首次发现了1个介导TGF-β促进肿瘤转移的LncRNA，并将这个新LncRNA命名为Lnc-ATB。有研究发现，Lnc-ATB在肝细胞癌患者组织中表达水平异常升高，在肝细胞癌患者转移灶中的表达则进一步上调，其表达水平与肝细胞癌的侵袭特征呈正相关，与肝细胞癌患者的不良预后亦呈正相关[14]。本研究主要探讨TGF-β在食管癌中是否通过激活Lnc-ATB参与肿瘤的进展，结果显示给予TGF-β后，食管癌细胞的侵袭及转移能力增强，同时Lnc-ATB的表达升高，而沉默食管癌细胞中Lnc-ATB的表达，给予TGF-β后，细胞的侵袭及转移能力并未增强。以上实验结果说明在食管癌中TGF-β通过上调Lnc-ATB的表达促进肿瘤细胞的侵袭及转移。本研究为探索食管癌远处转移的机制提供了理论基础，为食管癌的治疗提供了新的分子靶标。