红葡萄酒中苹果酸测定方法的比较

赵永春，袁猛，袁晓林，车兆虹，田宝荣（中国长城葡萄酒有限公司，河北怀来 075400）

苹果酸-乳酸发酵（Malolactic Fermentation，MLF）是在乳酸菌的作用下将苹果酸分解成乳酸和CO2的过程。这一过程使新葡萄酒的酸涩和粗糙感消失，而变得柔顺、舒软。经苹果酸-乳酸发酵后的红葡萄酒，酸度降低，果香、醇香变浓，呈现柔软、有皮肉和肥硕等特点，质量提高[1]。同时苹果酸-乳酸发酵还能增强葡萄酒的生物稳定性。自发MLF或野生乳酸菌容易导致品种香气损失，产生还原性气味等而降低酒品质量，随着葡萄酒消费需求的剧增和消费者对酒品品质要求的不断提高，各国酿酒师已意识到进行苹乳发酵对改善葡萄酒品质的重要性，酿酒师常常会添加乳酸菌启动MLF，因此如何判断苹乳发酵结束时间，及时做到控制发酵进程显得尤为重要[2-3]。而以苹果酸的含量作为指标检测控制苹乳发酵进程具有重要的意义。

目前，苹果酸的检测方法主要有纸层析法、液相色谱法、酶法、光谱法等，传统方法是采用纸层析法来判断苹乳发酵的进程。纸层析法主要依据苹果酸在展开剂中的移动速度来判断，通过观察滤纸上苹果酸显色斑点的大小直观判断苹乳发酵进程。该法耗时较长，且平行性、定量性较差，对生产会造成一定延误，而且所用的有机溶剂等常具有挥发性，并有一定毒性。液相色谱法具有快速、灵敏、重现性好等优点，但对实验设备要求高。酶法测定快速、简便、特异性良好，在国外已得到广泛应用[4-7]。光谱法测速快、易操作、污染小[8]，故本文将光谱法和酶法与纸层析法进行了比较，以此替代纸层析法来判断苹乳发酵的结束时点。

FOSS公司的葡萄酒全分析仪WineScan™ Flex（以下简称FOSS仪）可以测试多类型的样品，包括发酵的葡萄汁、葡萄原酒和成品葡萄酒。FOSS仪采用了FTIR傅里叶变换红外光谱技术，快速分析出葡萄酒中的多项指标，包括酒精度、还原糖、葡萄糖、果糖、总酸、挥发酸、pH、苹果酸、乳酸等指标[9]。

Y15主要是通过酶反应原理测定苹果酸的含量。样品中的苹果酸通过反应产生NADH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸），因为NADH生成量与苹果酸含量呈正比，且在340 nm处有吸收峰，故通过分光光度计测定NADH的生成量，计算苹果酸含量[4]。

1 材料与方法

1.1 材料

沙城产区‘赤霞珠’干红葡萄酒。

1.2 仪器与设备

WineScan™ Flex葡萄酒成分快速分析仪（丹麦F O S S 公司）；Y 1 5分析仪（Biosystems公司）；滤纸沃特曼1号或新华1号；层析缸；微量取样器等。

1.3 方法

1.3.1 试剂的配置

50%乙酸；溴酚蓝的丁醇液：在1 L丁醇中加入1 g溴酚蓝溶解后（不能加热）即得到溴酚蓝的丁醇溶液；展开剂：取50 mL溴酚蓝丁醇液与25 mL 50%乙酸混合即得到展开剂。

1.3.2 苹果酸的测定

（1）层析法测定苹果酸[10]。

（2）FOSS测定苹果酸。将酒样倒入10 mL试管中，按仪器操作说明进行操作，测出结果并记录。

（3）Y15测定苹果酸。按仪器说明说将酒样和试剂盒放入仪器中，按照程序测定，记录结果。

1.3.3 纸层析法结果判断

在蓝紫色的底面上有黄色的斑点，酒石酸的速度慢，在最下方；乳酸和琥珀酸的速度最快，被推动剂带到滤纸的顶端，苹果酸则处于它们两者之间。如果应在苹果酸出现的位置上没有黄色斑点，而在乳酸的位置处有明显的黄色斑点则表示苹果酸-乳酸发酵已经完成；反之，如果在苹果酸出现的位置上有黄色斑点，而在乳酸的位置处没有黄色斑点，则表示苹果酸-乳酸发酵尚未开始；对于苹果酸和乳酸的位置上均有黄色斑点则说明苹果酸-乳酸发酵正在进行中，还尚未完成。试验所得数据采用SPSS 21.0数据处理系统进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 FOSS分析结果与纸层析法结果的比较

根据实践经验，发现FOSS仪检测结果苹果酸含量≤0.6 g/L时，纸层析法检验结果为苹乳发酵结束；而＞0.6 g/L时，纸层析法检测苹乳发酵还未结束。为了进一步验证该结果是否具有可靠性，将检验结果通过SPSS 21.0数据处理系统进行卡方分析。结果见表1与表2。

表1 苹果酸含量分组结果（交叉制表）Table 1 Results of malic acid content grouping (cross tabulation)

表2 卡方检验Table 2 Chi-square tests

试验共测定82个样本，样本量N＞40，且交叉表中每个单元格中期望计数大于5，卡方检验结果是精确的，可以参考表2第一行的指标，Pearson卡方显著性值为0.000，小于0.05，表明差异显著，说明苹果酸含量在＞0.6 g/L和≤0.6 g/L的差异具有统计学意义，即两个组之间具有差异，说明0.6 g/L是苹乳发酵是否结束的分界点。既可以用FOSS测出的结果≤0.6 g/L来表明苹乳发酵结束。以此来代替纸层析法。

2.2 Y15分析结果与纸层析法的比较

根据实践经验发现，Y15检测结果苹果酸含量为≤0.4 g/L时，纸层析法检验结果为苹乳发酵结束；而＞0.4 g/L时，纸层析法检测苹乳发酵还未结束。为了进一步验证该结果是否具有可靠性，将检验结果通过SPSS 21.0数据处理系统进行卡方分析。结果见表3和表4。

表3 苹果酸含量分组结果（交叉制表）Table 3 Results of malic acid content grouping (cross tabulation)

试验共测定了82个样本，样本量N＞40，且交叉表中每个单元格中频数均大于5，卡方检验结果是精确的，可以参考表4第一行的指标，Pearson卡方显著性值为0.000，小于0.05，表明差异显著，说明苹果酸含量在＞0.4 g/L和≤0.4 g/L的差异具有统计学意义，即两个组之间具有差异，说明0.4 g/L是苹乳发酵是否结束的分界点。既可以用Y15测出的结果≤0.4 g/L来表明苹乳发酵结束。以此来代替纸层析法。

2.3 FOSS测定结果和Y15测定结果相关性分析

检验结果通过SPSS 21.0数据处理系统分析得到表5。由表5得出，FOSS和Y15所测结果显著相关，相关系数为0.983。说明FOSS和Y15所测结果具有统计学意义上的相关性。

表4 卡方检验Table 4 Chi-square tests

表5 FOSS和Y15方法的相关性分析Table 5 Correlation analysis of FOSS and Y15 methods

3 讨论与结论

采用纸层析法测定苹乳发酵结束的样本，其用FOSS测定苹果酸含量结果都在0～0.6 g/L范围；用Y15测定苹果酸含量结果在0～0.4 g/L，且FOSS与Y15分析结果具有相关性。采用FTIR傅里叶变换红外光谱技术，不需特殊处理样品，也不消耗有毒试剂，简化了常规分析程序，该方法使检验人员远离化学有害物质，降低了危险性，减少环境污染。最为重要的是，FOSS和Y15检验时间均能大大缩短，FOSS测定只需30 s，Y15检测约需10 min，而纸层析则需要长达10 h的反应时间，且两方法特异性好、操作简便，因此可采用F0SS和Y15检测的方法来监测生产过程中苹果酸的含量，代替纸层析法判断MLF结束。当FOSS仪（或Y15）检测结果苹果酸含量≤0.6 g/L（或≤0.4 g/L）时，即可判定为MLF结束，能及时反映产品状况，满足生产需要，改善因耗时长而带来的延误，达到改善葡萄酒风味的目的。