正交法优选六安瓜片中茶多酚的提取工艺

李林刚，周 威，郑诗成，张世荣，王浩飞，邵海斌，余学永

(1.皖西学院 材料与化工学院，安徽 六安 237012；2.安徽仿生传感与检测技术省级重点实验室，安徽 六安 237012；3.皖西学院 外国语学院，安徽 六安 237012；4.六安市海洋羽毛有限公司，安徽 六安 237142)

茶(拉丁学名：Camellia sinensis )在我国种植面积很广，主要分布在山区。茶叶中含有的茶多酚是一种天然的保健品，茶多酚又名茶丹宁，是从茶叶中经过多道工序得到的多羟基酚类混合物，同时它也是茶叶中具有抗氧化功能的主要成份之一，被广泛用作食品添加剂[1-6]，因此，茶多酚的应用价值非常高。茶多酚的提取方法比较多，主流方法是有机溶剂萃取技术[7]，但由于有机溶剂萃取法和超临界萃取法两者的提纯工艺较为复杂，而且提取物也会被其他有机溶剂附着，使得提取物不纯净。本实验主要以通过设计五因素四水平的正交实验，在超声波辅助技术下研究茶多酚的工艺，并寻求最佳提取工艺条件。

1 实验部分

1.1 药品和仪器

1.1.1 实验药品

实验采用的绿茶为六安瓜片(产地：六安大别山区)；主要试剂为；主要试剂为硫酸亚铁、酒石酸钾钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和和乙醇等，等，均为分析纯。

1.1.2 实验仪器

粉碎机(9FQ-420型，山东新圣泰机械有限公司)；超声波清洗器(KQ-500DE型，昆山市超声仪器有限公司)；紫外可见光栅分光光度计(Alpha-1900,上海谱元仪器有限公司)；循环水真空泵(SHB-2IIIA型，临海市永昊真空有限公司)；电子天平(BS150M型，中国浙江绍兴分析仪器)。

1.2 实验内容

1.2.1 超声波辅助浸提

准确称取1.0000 g左右茶叶用搅碎机搅碎后过60目筛放置于100 ml的离心管中，加入一定量的乙醇溶液后放置于超声波清洗机中。放置时用离心管架固定好，开启超声波清洗机辐射，控制好提取时间和温度，超声结束后立即真空抽滤。

1.2.2 茶多酚的含量测定

茶多酚含量的测定按GB/T 8313—2002《茶：茶多酚的测定》进行。其原理是茶叶中多酚类物质能与亚铁离子形成紫蓝色络合物，络合物溶液颜色的深浅与茶多酚物质的含量成正比，通过比色法，用光密度表示茶多酚的含量。准确吸取经抽滤过后的茶多酚浸提液2 ml，注入50 ml的容量瓶中，加水8 ml和酒石酸铁溶液10 ml,充分混合，再加pH 7.5缓冲溶液至刻度，以纯水为空白对照，将以上处理的以上处理的试样溶液装于10 mm比色中，并于540 nm处测定吸光度A，每个试样重复测定3次，茶多酚的提取率按以下公式(1)计算

(1)

上式中：V1为试液的总体积/ml；V2为测定时所用试液体积/ml；M为茶粉的质量/g；A为试样的吸光度；1.957为用10 mm比色杯，当吸光度等于0.50时，每毫升茶汤中所含茶多酚的质量/mg。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 不同乙醇体积分数对六安瓜片中茶多酚提取率的影响

准确称取6份质量为1.0000 g左右的六安瓜片粉末，然后向离心管中分别加入体积分数从30%到80%的乙醇溶液各30 ml，每次增加10%的浓度梯度，在水浴温度为60 ℃，超声波功率为270 W的条件下提取45 min,经抽滤得到茶多酚的浸提液，然后精确量取2.00 ml的滤液测定其吸光度并计算其提取率，结果见图1。

图1 不同乙醇体积分数对六安瓜片中茶多酚提取率的影响

通过观察图1的趋势可知：在一定乙醇浓度范围内，六安瓜片中的茶多酚提取率随乙醇溶液体积分数的增加先升后减。当乙醇体积分数达到50%时提取率取得最大值为10.30%；根据相似相溶原理，这种现象产生的主要原因是六安瓜片中的多酚类物质具有一定强度的极性，当乙醇体积分数为50%时的极性刚好与其相似，使得六安瓜片中的多酚类物质具有最大溶解度[8]。而乙醇体积分数低于50%时，六安瓜片中的茶多酚类物质浸出不完全，当体积分数高于50%又会造成除茶多酚以外的杂质溶解出来，有效成分减少。因此，乙醇体积分数为50%左右为宜。

2.1.2 不同温度对六安瓜片中茶多酚提取率的影响

保持乙醇体积分数为50%，超声波功率270 W，改变水浴温度，从30 ℃增加到70 ℃，每次改变10 ℃，提取时间45 min，经抽滤得到茶多酚的浸提液，然后精确量取2.00 ml的滤液测定其吸光度并计算其提取率，结果见图2。

图2 不同温度对六安瓜片中茶多酚提取率的影响

通过观察图2的曲线走势可知：在低于60℃的条件下，六安瓜片中茶多酚的提取率随着提取温度的升高而逐渐增大。提取温度达到60 ℃时达到最高提取率为10.32%；当温度继续升高后，可以发现六安瓜片中茶多酚的提取率开始下降。根据相关研究发现[8]，在一定温度范围内，温度的上升会加速分子的热运动，在60 ℃之前由于分子热运动使得茶多酚逐渐从叶肉细胞中溶出，但一旦超过一定温度茶多酚的活性会下降，所以温度应控制在60 ℃左右为宜。

2.1.3 不同超声功率对六安瓜片中茶多酚提取率的影响

保持乙醇体积分数为50%，温度60 ℃，分别在超声波功率为90 W、180 W、270 W、360 W、450 W、540 W的条件下处理45 min，经抽滤得到茶多酚的浸提液，然后精确量取2.00 ml的滤液测定其吸光度并计算其提取率，结果见图3。

图3 不同超声功率对六安瓜片中茶多酚提取率的影响

由图3可以看出，超声功率在360 W以前，随着功率逐渐增大，茶多酚的提取率迅速上升。产生这种现象的原因主要是因为超声波的振动频率越快，对叶肉细胞的空化作用也就越强[10]，所以茶多酚等物质的溶出速度也就越快。功率一旦超过360W时，所对应的茶多酚提取率反而会下降。这可能是由于在过高功率的提取环境下，茶多酚活性成分会有所破坏[8]。而功率过低时，超声波对细胞壁的破坏能力不强从而提取率也不高。因此，360 W的功率是超声波提取的最适功率。

2.1.4 不同超声时间对六安瓜片中茶多酚提取率的影响

保持乙醇体积分数为50%，温度60 ℃，超声波功率360 W的条件下，将六份提取物分别处理30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min。经抽滤得到茶多酚的浸提液，然后精确量取2.00 ml的滤液测定其吸光度并计算其提取率，结果见图4。

图4 不同时间对六安瓜片中茶多酚提取率的影响

从上图看出，前60 min茶多芬的浸出率随时间的增加而增大，在60 min时达到最高提取率10.40%。提取率随提取时间的变化可分为三个阶段：前期恒速扩散段、中期降速段和提取后期段。在提取前期，茶多酚通过茶叶细胞壁向细胞内扩散，此时茶叶细胞内有效成分含量呈现过饱和状态，随着提取时间的延长，茶叶细胞内的茶多酚含量逐渐向非饱和状态迁移，所以提取溶剂中茶多酚含量逐渐增大。

2.1.5 不同料液比对六安瓜片中茶多酚提取率的影响

准确称取6份质量为1.0000 g的六安瓜片粉末，分别加入体积分数50%的乙醇溶液15 ml、20 ml、25 ml、30 ml、35 ml、40 ml，放置于水浴温度为60 ℃的环境下，在超声波功率为 360 W的条件下处理60 min。经抽滤得到茶多酚的浸提液，然后精确量取2.00 ml的滤液测定其吸光度并计算其提取率，结果见图5。

图5 不同料液比对六安瓜片中茶多酚提取率的影响

从上图可以观察出，当液固比从15∶1增加到30∶1茶多酚的浸出率逐渐增大，液固比达到30∶1时茶多酚的提取率为10.38%；但是液固比进一步提高时，六安瓜片中茶多酚的浸出率却下降。这种现象的原因液固比的增加使得溶剂与物料之间的浓度差加大，同时也加大了茶粉与乙醇的接触面积，从而有助于相关物质的溶解。而液固比过大可能会导致提取出的杂质增加，影响六安瓜片中茶多酚的溶出。因此，液固比宜控制在30∶1左右。

2.2 正交实验

2.2.1 正交实验设计与结果分析

通过单因素实验，选定乙醇体积分数(A)，温度(B)，超声功率(C)固液比(D)时间(E)作为本实验的影响因素，经过单因素实验结果分析，最终确定了正交实验的各因素水平，详见表1.为探究超声波辅助法提取六安瓜片中茶多酚的最佳提取条件，选择L16(45)正交表安排各实验的因素水平[9]，正交设计如表1。

根据表2的正交实验结果，通过对比均值可以发现A3、B3、C2、D3、E4为最佳提取条件，并比较各列的极差结果不难看出C的极差是最大的，其次是A、D、E、B，也即超声功率对茶多酚的提取率是最明显的，乙醇的浓度次之。由于超声波的三大效应：热效应、机械破碎效应、空化效应使得叶肉细胞中的多酚物质快速溶出其中其主要作用的是空化效应即在一定的声强下造成气泡的产生，膨胀和溃灭的过程中能够释放很强的能量，一方面加速溶剂的进入，另一方面加大了对植物细胞的剪切作用从而使得相关物质的释放更快[7]。

2.2.2 方差分析

根据正交实验结果，进行方差分析如表3。

表1 L16(45)正交表设计

表2 正交实验结果

表3 正交实验方差分析

从表3的相关数据显示，六安瓜片中茶多酚提取率的影响因素排序从小到大分别为B、E、D、A、C，此结果基本与表2的极差分析相同。所以结合两者数据分析的结果可得出超声波辐射法的最优提取条件为A3B3C2D3E4 。即最优工艺条件为：乙醇体积分数50%，提取温度为60 ℃，超声功率为270 W，料液比为1∶30，浸提时间为65 min。重复最佳提取条件实验得茶多酚的提取率为10.41%。

3 结论

本实验以采摘于六安大别山区的六安瓜片为原料，采用超声波辅助提取工艺技术，分别改变乙醇的体积分数、超声浸提时间、固液比、超声波的震动频率、超声浸提温度，设计五因素四水平的正交实验，探究这五种因素对茶多酚浸提率的影响。结果表明，最优的提取条件为：固液比为1∶30、乙醇体积分数50%、超声提取温度为60 ℃、超声功率为270 W、浸提时间为65 min。重复三次最优浸提条件得茶多酚的提取率为10.41%。结合单因素处理结果，经正交法所处理得提取条件更加接近最优值。