两种色谱柱分离37种脂肪酸组分研究

邹燕娣，包李林，周青燕，熊巍林，张谦益，周双全

(道道全粮油股份有限公司 规划发展研究院质量管理中心，湖南 岳阳 414000)

随着现代生活水平的提高，人们对饮食越来越重视，食用植物油作为日常生活中的必需品，其品质和营养价值也日益受关注[1-3]。植物油中组分较复杂，从四碳酸到二十二碳酸的碳链长度，共有37种脂肪酸。亚油酸和亚麻酸是人体必需的脂肪酸，具有防止血液中胆固醇的增加和沉积、软化血管、防止高血压和心血管疾病等功能[4-11]。在不饱和脂肪酸中，按照几何异构体的不同可分为顺式和反式脂肪酸；按照第一个双键距离甲基端数目的差异主要有n-3、n-6和n-9系脂肪酸。顺式结构的油酸或亚油酸容易被人体吸收，可软化人体血管，而反式结构的不被人体吸收，且长期食用会对人体血管产生不良影响，因而有必要对顺式和反式结构的脂肪酸组分进行测定，以判定油脂的品质[12-13]。目前，国标或文献资料主要采用气相色谱结合100 m的强极性柱分离37种脂肪酸组分，但并没有就37种脂肪酸组分的分离条件进行详细研究，比如标样质量浓度、分流比、色谱柱流速或程序升温；且30 m的强极性柱是否能应用于油样中37种脂肪酸组分的分离也没有相关或具体的研究[14-15]。据了解100 m的色谱柱价格将近10 000元，而30 m的色谱柱只需要3 000多元，成本较低。本试验研究两种常用的强极性色谱柱(CD-2560和DB-WAX)分离37种脂肪酸混合标样和植物油，探索最佳分离条件，为测定植物油中各种脂肪酸组分提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

37种脂肪酸甲酯混标(10 mg/mL，1 mL)分别为C4∶0、C6∶0、C8∶0、C10∶0、C11∶0、C12∶0、C13∶0、C14∶0、C14∶1、C15∶0、C15∶1、C16∶0、C16∶1、C17∶0、C17∶1、C18∶0、C18∶1n9t、C18∶1n9c、C18∶2n6t、C18∶2n6c、C20∶0、C18∶3n6、C20∶1、C18∶3n3、C21∶0、C20∶2、C22∶0、C20∶3n6、C22∶1n9、C20∶3n3、C20∶4n6、C23∶0、C22∶2、C24∶0、C20∶5n3、C24∶1、C22∶6n3，上海安谱；异辛烷，色谱纯；氢氧化钾，分析纯；甲醇，色谱纯，Sigma公司；超纯水；0.5 mol/L氢氧化钾-甲醇溶液；四级菜籽油、大豆油、一级葵花籽油、芝麻油、玉米油，公司自给。

1.1.2 仪器与设备

7890B安捷伦高效气相色谱仪；CD-2560色谱柱(100 m×0.25 mm×0.20 μm)；DB-WAX色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液的配制

将37种脂肪酸甲酯混标用异辛烷稀释至10 mL，质量浓度为1 mg/mL，于-20℃保存。

1.2.2 样品前处理

称取油样约0.05 g至10 mL具塞比色管中，加入4 mL异辛烷，摇匀，然后加入1 mL 0.5 mol/L氢氧化钾-甲醇溶液，置于旋转混匀器上于1 500 r/min 旋转2 min，加入1 mL超纯水，继续旋转1 min，静置分层后，取上层清液待测。

1.2.3 气相色谱分析条件

进样口温度280℃；检测器温度290℃；隔垫吹扫流量3 mL/min；载气为氮气，纯度0.999 99；空气纯度0.999 99；氢气由氢气发生器制备；进样量1 μL。

2 结果与分析

2.1 CD-2560色谱柱色谱条件的探讨

2.1.1 色谱柱流速的影响

固定混标质量浓度为1 mg/mL，分流比为 70∶1，程序升温为100℃保持5 min，以3℃/min速率上升至230℃,保持30 min，色谱柱流速分别设定为0.7、0.6、0.55、0.5、0.45 mL/min。结果发现：当流速为0.7 mL/min时，37种组分中C24∶0和C20∶5n3的峰分不开；当流速为0.6、0.55、0.5 mL/min时，37种脂肪酸分离度均良好；当流速为0.45mL/min 时，37种组分中C23∶0和C20∶4n6的峰分离度差。本试验选择色谱柱流速为0.55 mL/min，其气相色谱图如1所示。

注：1.C4∶0；2.C6∶0；3.C8∶0；4.C10∶0；5.C11∶0；6.C12∶0；7.C13∶0；8.C14∶0；9.C14∶1；10.C15∶0；11.C15∶1；12.C16∶0；13.C16∶1；14.C17∶0；15.C17∶1；16.C18∶0；17.C18∶1n9t；18.C18∶1n9c；19.C18∶2n6t；20.C18∶2n6c；21.C20∶0；22.C18∶3n6；23.C20∶1；24.C18∶3n3；25.C21∶0；26.C20∶2；27.C22∶0；28.C20∶3n6；29.C22∶1n9；30.C20∶3n3；31.C20∶4n6；32.C23∶0；33.C22∶2；34.C24∶0；35.C20∶5n3；36.C24∶1；37.C22∶6n3。

图1 CD-2560色谱柱流速为0.55 mL/min时37种脂肪酸组分气相色谱图

2.1.2 分流比的影响

固定混标质量浓度为1 mg/mL，色谱柱流速为0.55 mL/min，程序升温为100℃保持5 min，以3℃/min速率上升至230℃，保持30 min，分流比分别设为10∶1、30∶1、50∶1、60∶1、70∶1。试验结果表明：当分流比为10∶1～70∶1时，37种脂肪酸甲酯组分均能完全分离。考虑到分流比太小，会因油样中的油酸和亚油酸浓度过大，导致C18∶1n9t和C18∶1n9c、C18∶2n6t和C18∶2n6c这两组峰分离效果不佳，但是分流比太大，也会使得油样中一些微量组分未能检测出来，如C24∶0、C24∶1等。综合考虑，本试验选择分流比为70∶1。

2.1.3 程序升温的影响

固定混标质量浓度为1 mg/mL，色谱柱流速为0.55 mL/min，分流比为70∶1，分别设定程序升温：程序升温①，100℃保持5 min，以3℃/min速率上升至230℃，保持30 min；程序升温②，130℃保持5 min，以3℃/min速率上升至230℃，保持30 min；程序升温③，100℃保持13 min，以10℃/min速率上升至180℃，保持6 min，以1℃/min速率上升至200℃，保持20 min，以4℃/min速率上升至230℃，保持30 min。

试验结果表明：当采用程序升温①和②时，37种脂肪酸组分分离良好，但是采用程序升温①时，C4∶0分离效果比程序升温②佳；当采用程序升温③时，只能分离35种脂肪酸，其中C24∶0和C20∶5n3分不开。因此，本试验采用程序升温①。

2.2 DB-WAX色谱柱色谱条件的探讨

试验结果表明，色谱柱DB-WAX的最佳分离条件为：混标质量浓度1 mg/mL，色谱柱流速0.55 mL/min，分流比70∶1，程序升温为100℃保持5 min，以3℃/min速率上升至230℃，保持50 min。其最佳分离效果如图2所示。

注：1.C4∶0；2.C6∶0；3.C8∶0；4.C10∶0；5.C11∶0；6.C12∶0；7.C13∶0；8.C14∶0；9.C14∶1；10.C15∶0；11.C15∶1；12.C16∶0；13.C16∶1；14.C17∶0；15.C17∶1；16.C18∶0；17.C18∶1n9c、C18∶1n9t；18.C18∶2n6c、C18∶2n6t；19.C18∶3n6；20.C18∶3n3；21.C20∶0；22.C20∶1；23.C20∶2；24.C21∶0；25.C20∶3n6；26.C20∶3n3；27.C20∶4n6；28.C22∶0；29.C22∶1n9；30.C22∶2；31.C23∶0；32.C24∶0；33.C24∶1；34.C20∶5n3；35.C22∶6n3。

图2 DB-WAX色谱柱分离37种脂肪酸组分最佳气相色谱图

将四级菜籽油分别采用CD-2560色谱柱和DB-WAX色谱柱测定其脂肪酸组成。根据CD-2560色谱柱测定37种脂肪酸标样组分出峰顺序，得出四级菜籽油各组分含量和名称，再将其与DB-WAX色谱柱测定的四级菜籽油色谱图进行比较，将含量几乎一致的命为同一种物质，得出各种组分含量和名称，如图3所示。

由图2可知，C18∶1n9c、C18∶1n9t和C18∶2n6c、C18∶2n6t，这两组同分异构体并没有分离，但是四级菜籽油样中的却能分离(图3)，具体原因有待研究。综上所述，DB-WAX色谱柱可用于37种脂肪酸组分的测定。

2.3 样品的测定

分别采用CD-2560色谱柱和DB-WAX色谱柱对四级菜籽油、芝麻油、一级葵花籽油、大豆油、玉米油5种油样进行脂肪酸组成测定，结果见表1。

从表1可知，CD-2560色谱柱和DB-WAX色谱柱对油样中脂肪酸组成及含量测定结果几乎一致，说明两者的分离效果相当。四级菜籽油中不饱和脂肪酸含量最高，达92.56%，饱和脂肪酸含量为6.76%，其余4种植物油的不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸含量相差不大，分别约为83%和15%。

注：1.C14∶0；2.C15∶0；3.C16∶0；4.C17∶0；5.C17∶1；6.C18∶0；7.C18∶1n9c；8.C18∶1n9t；9.C18∶2n6c；10.C18∶2n6t；11.C18∶3n6；12.C18∶3n3；13.C20∶0；14、15.C20∶1；16.C20∶2；17.C21∶0；18.C20∶4n6；19.C22∶0；20、21.C22∶1n9；22.C23∶0；23.C24∶0；24.C24∶1。

图3 DB-WAX色谱柱分离四级菜籽油脂肪酸组成气相色谱图

续表1%

脂肪酸DB-WAX色谱柱CD-2560色谱柱四级菜籽油一级葵花籽油芝麻油玉米油大豆油四级菜籽油一级葵花籽油芝麻油玉米油大豆油C20∶3n6- - - - - - - - - - C21∶0- - - - 0.030- 0.028- - 0.270C22∶00.5100.3900.1800.1500.3700.4900.3800.1600.1100.360C22∶1n921.1900.2500.2700.3700.26020.3400.0300.0300.2400.250C22∶20.2700.1500.2300.0700.1900.250- 0.0500.0680.190C23∶0- 0.070- - 0.066- 0.130- - 0.065C24∶00.1900.1300.1000.1300.0960.2100.0800.1100.1400.095C24∶10.5800.0200.0100.0510.5500.0200.0100.0600.052C20∶4n6- - - - - - - - - - C20∶5n3- - 0.150- 0.069- 0.160- - 0.068C22∶6n3- - - - 0.370- - - - 0.370饱和脂肪酸6.76015.10015.17013.78015.3006.87015.56015.33014.34015.890不饱和脂肪酸92.56082.72083.83085.67083.06091.63083.93083.14085.24085.460

3 结 论

分别采用CD-2560色谱柱和DB-WAX色谱柱对37种脂肪酸标样和油样进行脂肪酸分离。CD-2560色谱柱和DB-WAX型色谱柱最佳分离条件为：混标质量浓度1 mg/mL，柱流速0.55 mL/min，分流比70∶1，程序升温为100℃保持5 min，以3℃/min速率上升至230℃(CD-2560色谱柱保持30 min，DB-WAX色谱柱保持50 min)。采用这两种色谱柱用于5种油样中脂肪酸组分含量的测定，分离效果几乎一致，说明CD-2560色谱柱和DB-WAX色谱柱均能较好地应用于植物油中37种脂肪酸组成的测定。