蜜蜂黑蜂王台病毒病研究进展

梁利 金汤东 张丽 刁青云 侯春生

（1中国农业科学院蜜蜂研究所，北京 100093；2中国农业科学院研究生院， 北京 100081；3浙江慈溪市亿园蜜蜂授粉专业合作社，慈溪 315334）

1 引言

蜜蜂是与人类以及大自然密切相关的社会性昆虫，它不仅可以为人类提供营养价值高的蜂产品，而且通过为开花植物授粉维持生态平衡，对保护和维持生物多样性起着十分重要的作用[1]。但是蜜蜂是社会性昆虫，易受到病毒、细菌、真菌及寄生虫的威胁，严重影响蜂群的健康发展。除此之外，病害的发生易导致乱用药，影响蜂产品的质量，进而给蜂农造成严重的经济损失[2]。在蜜蜂的多种病原中，病毒由于分子小、易突变的特点而备受关注。目前已分离得到的蜜蜂病毒至少有20种，大多数为小RNA病毒，至少有9种病毒已完成了全基因组测序[3]。其中黑蜂王台病毒（BQCV）是引起蜂王幼虫及蛹感染的主要病原，该病原通过黑化蜂王幼虫并可导致巢房变黑，进而引发蜂王坏死于巢房内。大量研究发现，BQCV的流行与蜜蜂卷翅病毒（Deformed Wing Virus，DWV）及Nosema ceranae等其他病原的发生具有很强的相关性。

2 病原学

BQCV首次分离于蜂王的幼虫和蛹，在死亡的蜂蛹中依然可以检测到[4]。BQCV属于微小核糖核酸病毒，是单链正义RNA病毒[5]，2002年Mayo[6]首次将其归于双顺反子病毒科（Dicistroviridae），蟋蟀麻痹病毒属（Cripavirus）。其病毒粒子直径约30nm，结构为正二十面体圆形，无囊膜。Leat等人在2000年首次完成全基因组序列测序，证实该序列包括ORF1和ORF2两个阅读框，ORF1与ORF2之间存在一个非编码区，为内核糖体进入位点（IRES），可启动ORF2的翻译，同样在5′端UTR也含有一个内核糖体进入位点[7-11]。基因组结构如图1。

图1 BQCV的基因组结构图

通过比较不同来源的BQCV基因组序列，发现ORF1序列更多样，相似度低，而ORF2的同源性强，是高度保守序列。ORF2所编码的VP1、VP2、VP3、VP4四个结构蛋白，保护病毒核酸，四个结构蛋白的分子量分别为34、42、29和6KDa。而ORF1主要由非结构蛋白构成，包含解旋酶、3C样半胱氨酸蛋白酶和依赖RNA的RNA聚合酶3种非结构蛋白。基因组中5′端的连接蛋白和3′末端Ploy（A）具有保护和维持基因组稳定的功能。

3 流行病学

3.1 流行范围与种类

1977年Baily等[12]首先报道了BQCV。BQCV首次分离自死亡的蜂王幼虫和蜂蛹，随后在工蜂、雄蜂中都能检测到该病毒，Tentchev等[13]首次用PCR技术检测法国地区疑似健康的蜂群，证实了蜂群中有6种蜜蜂病毒的存在，包括BQCV，表明BQCV在蜂群中大多建立的为隐性感染。研究结果表明，BQCV对成年工蜂的感染率是86%，对蛹的感染率为23%，但工蜂等成年蜂并不会发病，没有表现明显的疾病症状，在染病的工蜂肠道中可以检测到该病毒，但含量很低[9]。这些都证实工蜂携带了BQCV，但是通过接触或喂饲可能感染蛹和蜂王幼虫。国际上对蜜蜂病毒流行调查起步较早。匈牙利学者采集了自1999年至2004年的蜂样，检测了DWV、BQCV、急性麻痹病毒（ABPV）、囊状幼虫病毒（SBV）、慢性麻痹病毒（CBPV）、卡什米尔病毒（KBV）6种常见的蜜蜂病毒，发现DWV和BQCV流行率分别为72%和54%[14]。同样，在以色列的意蜂中BQCV流行率是最高的，达到75%[15]。而蜂群中最重要的个体-蜂王，也是感染蜜蜂病毒最严重的个体之一，并且在蜂王不同组织及粪便物中检查DWV、BQCV、ABPV、SBV、CBPV、KBV的发生，发现DWV和BQCV在中肠的感染水平最高，而SBV与CBPV在血淋巴的水平明显高于其他组织[16]。

Li等[17]研究发现BQCV在中国中蜂的感染率较高，在19个省中的6个省发现了BQCV，甘肃省感染率（98%）高于在河南省（12%）的感染率。最近，刁青云等对我国部分省区的蜂样调查发现，BQCV是意蜂感染率最高的病毒[18]。另外，研究发现BQCV可以感染熊蜂等野生授粉昆虫，发现DWV、BQCV、SBV和IAPV均存在于熊蜂中[19]。而对另一重要当地蜂种萨凡纳蜜蜂调查发现，BQCV流行于南非23%的萨凡纳蜜蜂（Apis mellifera scutellata）蜂群中，但不能检测到ABPV、CBPV、DWV和SBV[20]。

3.2 传播途径

BQCV在蜜蜂的各种产物（蜂蜜、花粉、蜂王浆）中均可检出，并能感染不同发育阶段的蜜蜂，卵、幼虫、蛹和成虫都是感染对象[21]。研究表明，BQCV可通过水平和垂直途径传播，既可以在同一世代的不同个体间扩散，又可以通过交配感染受精卵进行垂直传播[2]。同时，也存在潜在的载体传播。

3.2.1 水平传播

蜜蜂可以通过接触、喂食、排泄物和唾液分泌物等传播该病毒。陈彦平等[22]先后在蜂蜜样品及蜂王的肠道内检测到BQCV。工蜂感染BQCV后无明显病症，但它们将病毒通过分泌的食物传染给蜜蜂幼虫。蜜蜂的很多行为，如护理蜂王、哺育幼虫、贮蜜等过程都会增加病毒传播的机会及蜜蜂在清理蜂房时，接触带病毒的粪便同样也会被感染[2]。

3.2.2 潜在的载体传播

蜜蜂微孢子虫病也是引起蜜蜂健康问题的重要蜜蜂疾病之一[23]。BQCV主要引起蜂王幼虫死亡，影响蜂王的预蛹期和封盖期，Bailey等[24]还研究发现，蜂群BQCV的爆发可能与微孢子虫病有关，观察发现，感染该病毒的蜜蜂常伴有微孢子虫感染。并且BQCV病毒可在患有微孢子虫病的成年蜜蜂上快速繁殖，春夏两季微孢子虫病爆发率最高的时期，BQCV的感染率也较高。体内存在BQCV的蜜蜂幼虫或成年蜜蜂并不会表现相关症状，处于隐性感染阶段，但当微孢子虫侵染蜂群时，BQCV开始活跃，并表现明显的临床症状，春季和夏初是BQCV爆发的流行季节[4]。

外寄生性螨-狄斯瓦螨（Varroa destructor）是引起蜜蜂蜂群大量损失的重要因素之一。感染大量蜂螨的蜂群中均可以检测到BQCV，表明可能是瓦螨通过吮吸蜜蜂血淋巴来削弱成蜂和蛹的免疫力，进而加快BQCV的快速增殖[25]。

目前狄斯瓦螨与BQCV的互作关系还不是很明确。一方面，有些研究发现瓦螨和BQCV存在同时感染，可以作为病毒的传播媒介，具有相关性。另一方面，Tentcheva[13]对于36个法国养蜂场的瓦螨样品进行检测，结果表明：86%的螨样未检测到BQCV。因此，蜂螨与BQCV的互作关系仍需进一步研究。

3.2.3 垂直传播

蜂王是蜂群唯一的产卵蜂，蜂王的健康直接影响着蜂群的状况，一旦蜂王染病将影响整个蜂群的健康发展。在蜜蜂的各个发育阶段都可以检测到BQCV，由于卵和幼虫阶段不会被瓦螨等寄生虫寄生，当病毒感染蜂王后，后代可以检测到BQCV，推测病毒可以由蜂王垂直传递到卵。并且Chen等[26]将感染病毒的蜂王产的卵表面进行消毒，然后检测卵同样发现了BQCV，也证实了BQCV可以通过蜂王垂直传播给后代。另外，在雄蜂和其精液中也检测到BQCV的存在，也为BQCV的垂直传播提供了有力证据，但是目前没有关于精子感染的相关实验。

3.3 感染症状与致病机制

BQCV感染蜜蜂后，蜂王预蛹期和封盖期受到较大影响，患病的蜂王身体变白，再慢慢变为黑，最后整个王台也全部变黑。被BQCV感染的蜜蜂，行为失常，神经系统受损，学习能力和记忆功能衰退，无法辨别方向，采蜜能力丧失，发病后期全身抽搐无法飞行而只能在地面爬行，感染的蜂王王台壁和蜂蛹均会变为黑色。并且BQCV在被蜜蜂微孢子虫感染的蜂王幼虫中快速增殖，加快王台变黑[27]。BQCV同样可以感染野生成年蜜蜂，感染后的症状也表现为王台壁变黑，在死亡的蜂蛹和幼虫中可以检测到不同浓度的BQCV病毒粒子，感染初期同感染囊状幼虫病死亡的幼虫颇为相似，蜂蛹呈白黄色，包裹一层坚韧的泡状外皮。另外，对感染的蜜蜂组织进行RT-PCR检测发现中肠的病毒水平最高，头、淋巴、卵巢、精囊病毒浓度相对较低。

蜜蜂对于病毒病的防御是很有限的，或者我们对蜜蜂抵抗病毒的免疫机制了解的不够。一方面，在进化中，嗅觉基因相对丰富，其他功能基因退化，导致蜜蜂自身的防御机制很弱，细胞吞噬作用对于病毒作用有限，可能是因为病毒可以在吞噬细胞中存活。另一方面，蜜蜂会同时感染其他疾病，弱化了相关的防御机制。BQCV和微孢子虫病发病季节相同，微孢子虫感染蜜蜂后会破坏中肠防御机制，从而使BQCV更加容易在中肠快速增殖。另外，微孢子虫传播的一个重要途径是依靠粪便，从而很易使微孢子虫与蜜蜂一起越冬，使得蜂群患病，也为BQCV的传播提供了机会。BQCV的爆发往往会伴随其他的蜜蜂病毒联合致病，例如蜜蜂残翅病毒、蜜蜂囊状幼虫病毒等蜜蜂病毒[28]。因此，其BQCV致病的机制仍未清晰，需要获得单一病原，分别实验及互作研究才能明确其致病机理。

4 检测方法

4.1 症状诊断

通过症状诊断是最廉价和方便的方法，但病毒感染的症状大多相似，当出现明显的症状时，病毒已经大规模爆发。蜜蜂蜂群会受到多种疾病的侵染，症状复杂难以判断，且症状相类似的病原很多，症状诊断并不可靠。因此，要获得确切结果还需要RT-PCR检测等分子手段。

4.2 基于免疫学的检测技术

将病毒蛋白或纯化病毒注入动物体内，待动物产生该病毒的抗体后，回收含有抗体的血浆并加入特定反应试剂后进行显色，这种方法价格低、检测速度快，但各蜜蜂病毒基因组之间存在一定的同源性，所以该方法的特异性较差，不适用于蜜蜂病毒的精准检测[29]。

4.3 PCR检测

RT-PCR定性检测技术应用十分广泛，首先收集患病样本，提取总RNA，进行反转录获得cDNA，通过PCR仪扩增后经电泳、纯化回收、提取质粒、测序等一系列步骤可准确鉴定出病毒种类[21]；而通过设计特异性探针的qRT-PCR定量检测同样适用于病毒检测[30]。实时荧光定量技术可以同时检测多个病毒，快速、准确、方便，是目前主流的检测方法。但是该方法对于样本有一定要求，RNA容易降解，需要将样本快速冷冻保存或在低温下运输。

随着PCR检测技术的发展，其快速、高效、简便的优点较为突出，多病毒同时检测是目前的发展趋势，Multiple RT-PCR[31]即多重RT-PCR在混合感染的鉴别诊断上具有其独特的优势和很高的实用价值。但是多重PCR技术要求也较高，其实验设计较单一PCR复杂，技术难度大，因而在建立多重PCR反应体系时，必须对其中的主要成分和反应条件进行系统性的优化[32]。

5 总结

BQCV在世界各个国家地区的蜂群广泛存在，BQCV在我国各省也均有分布，在国内西方蜜蜂蜂群中的感染率高于东方蜜蜂蜂群，野生蜂群中的感染率高于商业蜂群，成年蜜蜂中的感染率高于蜜蜂幼虫[14]。BQCV更易感染西方蜜蜂蜂群，更易感染成年工蜂，大多情况下建立隐性感染，而且BQCV常常与微孢子虫和蜂螨共感染。大量研究已经证实微孢子虫和BQCV的共感染，导致蜜蜂大量死亡，严重削弱蜂群群势，造成经济损失。目前无有效的手段治疗BQCV，但可以通过控制微孢子虫等寄生虫间接干预BQCV在蜂群中的流行与传播是一个可行的办法[33]。BQCV可水平传播（喂食、清理、接触、哺育），也可以垂直传播（交配），所以定期更换蜂王可以降低发病率和死亡率，提升蜂群抵抗力，减少蜂群的损失。另外，蜂群大多情况下只是携带病毒，当遇到外界压力因素，才会激活病毒快速增殖。因此，健康的管理方式，如保证食物充足、调节温湿度、做好消毒工作等日常管理工作，是避免病毒爆发的关键。另外，BQCV的基因组已经被解析，对于其结构也有了更深入的了解，未来可以从基因角度治疗或防御BQCV。同时，加强BQCV与其他重要病原的互作研究也将为深入探讨BQCV的致病机制提供重要的理论指导。

致谢本项目得到浙江省宁波市科技计划项目资助（2017C10011）。