基于Illumina 高通量测序的马来熊(Helarctos malayanus)粪便菌群多样性初探

袁耀华 刘群秀 裴恩乐

(上海动物园，上海，200335)

野生动物肠道微生物区系，作为一个生态系统，在维持动物个体的健康中发挥着十分重要的作用[1]，它密切影响着宿主的消化[2]、代谢[3]、营养[4]、免疫[5]和发育[6-7]等，因此肠道微生物群落又被称为“被遗忘的器官”[8]。肠道微生物区系的建立过程非常复杂，微生物通过幼龄动物与母体及生境的接触进入其肠道，并经过与宿主的相互适应、选择和协同进化[9]，逐渐形成稳定的肠道微生物区系[10-11]。正常情况下，肠道菌群对宿主具有生物屏障、抑制致病菌和腐败菌、提供营养、提高免疫力等促进健康作用，宿主则为肠道菌群提供生存环境[12]。因此，肠道菌群是一个复杂的生态系统，宿主、食物、肠道菌群之间通过互作保持动态的平衡与稳定，一旦这种平衡与稳定被打破，机体的健康状况会受到严重的威胁[13]。近年来，有关哺乳动物肠道微生物的研究涉及东北虎(Pantheratigrisaltaica)[14]、狼(Canislupus)[15]、大猩猩(Gorilla)[16]和大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)[17]等，发现大部分哺乳动物肠道微生物的菌种在生物学分类上基本属于5—8个门。研究表明，哺乳动物肠道微生物与宿主间存在着协同进化，其构成与宿主的进化历程、食性组成及消化等均有密切关系[18]。肠道菌群的传统研究方法为细菌培养法，该法准确率低，会使微生物资源大量丢失[19]；随着以16S rDNA为基础的分子生物技术如RAPD 、AFLP、DGGE、TGGE[20]等的发展，微生物检测工作得到了全面提高，但这些方法耗时长，工作量大，只能检测出一定丰度以上的菌群或某种特定微生物。近几年来，随着核酸测序技术的发展和测序成本的降低，高通量测序技术已在多个领域得到广泛应用，目前已成为微生物群落检测的最先进手段[21]，包括Illumina Solexa/GA平台，罗氏454测序平台、ABI SOLiD平台[22]和Miseq测序平台[23]，均得到广泛应用。

马来熊(Helarctosmalayanus)隶属于食肉目(Carnivora)、熊科(Ursidae)、马来熊属，是国家Ⅰ级重点保护野生动物，CITES将其列入附录I(www.cites.org)，IUCN将其评估为易危(VU)(IUCN 2017)。近年来，马来熊野外种群呈下降趋势(www.iucnredlist.org)，生境丧失导致其种群数量比100年前减少25%[24]。马逸清等对中国野生马来熊数量进行估计，认为其数量约为140只左右[25]，侯万儒和胡锦矗估计中国马来熊数量在145只左右[26]。有关马来熊的研究比较匮乏，主要集中在野外生态[27-31]、繁殖生理[32-35]、行为[36-40]、饲养[41-42]、疾病[43-47]和分子生物学[48-51]等方面，有关肠道微生物的研究尚未见报道。本研究首次引入Illumina Miseq高通量测序技术，对上海动物园圈养马来熊的粪便微生物开展研究，旨在通过粪便微生物探索马来熊肠道菌群的多样性及其优势组成，本研究将为今后马来熊肠道菌群的研究提供新的更准确、科学的数据资源，同时也为马来熊肠道菌群的分子生物学研究提供技术参考，同为深入研究马来熊胃肠道微生态、消化生理、生态防治和科学的饲养管理提供依据，为防治马来熊因肠道菌群失调而引起的疾病及胃肠道菌群的调控奠定理论基础。

1 研究方法

1.1 研究地点和研究对象

选取上海动物园的3只成年马来熊为研究对象，为确保研究对象的代表性和研究结果的准确性，所选马来熊个体均无腹泻病，出生至现在无明显疾病，且未使用过抗生素。3只马来熊的个体信息见表1。

实验期间所喂日粮包括：苹果、梨、香蕉、番茄、胡萝卜、黄瓜、熟土豆、鸡蛋、牛奶和窝头，窝头主要成分为：玉米、小麦、麸皮、豆粕、大麦、磷酸氢钙、石粉、无核枣、盐。

1.2 研究方法

1.2.1 样品收集

2013年12月，采集马来熊的新鲜粪便，为避免采样差异，所有样本采集工作由1人完成。收集粪便时佩戴一次性无菌手套，用消毒药匙选取粪便团中央的部分，放入无菌采样袋中，密封，-80℃冷冻保存，尽快提取粪便中的总DNA，以防细菌繁殖。每只马来熊取4次粪便，共取12个样本，分别将同一只马来熊4次所取的粪便样本混合成1份，共获得3份混合粪便样本。

表1 试验马来熊的个体信息

Tab.1 Basic information for the sun bears

1.2.2 DNA的提取

粪便总DNA的提取使用德国Qiagen公司生产的QIAamp DNA stool mini kit试剂盒完成，称取200 mg粪便样品于2 mL的离心管中，具体步骤按照QIAamp DNA stool mini kit试剂盒说明书进行操作，为了提高粪便中革兰氏阳性菌的破壁效率，在加入ASL后在95 ℃水浴锅中温育5 min，其余步骤同试剂盒说明书。最终提取的DNA溶于50 μL AE中。提取的总DNA经紫外分光光度计测定纯度，总DNA样品浓度不低于5 ng/μL，总量不低于10 μg，OD260/280值为1.8—2.0，OD260/230值大于1.5，1%琼脂糖凝胶电泳检测后于4 ℃保存备用。

1.2.3 16S rDNA V4区PCR扩增

以下过程在北京金唯智生物科技有限公司进行。细菌16S rDNA片段长度适中，有多个区段高度保守，信息量较大易于分析。根据16S rDNA的保守区域，可以设计出通用引物，用来扩增出群体中所有细菌的16S rRNA片段，通用引物序列如下：

上游引物，5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3′

下游引物：5′-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3′

扩增采用25 μL反应体系。16S rDNA基因的V4区进行PCR扩增后对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳回收纯化；构建DNA-seq测序文库，使用Illumina MiSeq平台进行高通量测序，测序长度2×250 bp，每个样品提供约0.3 M Reads。

1.3 数据处理及分析

对样品进行Illumina Miseq双末端(Pair-end)测序之后，需要对微生物群落16S rRNA测序结果的生物信息进行分析。先对测序结果进行图像识别(Base calling)，按照barcode标签完全匹配方式提取测序序列。使用NGS QC Toolkit v2.3软件对原始数据进行优化处理，去除引物和接头序列，质量控制，截断或者舍弃低质量序列，得到有效序列。用Mother(v.1.34.0)对Reads进行拼接，去除拼接结果中含有N的序列，筛选片段长度并去除嵌合体序列。筛选出的V4片段使用UCLUST方法进行OTU聚类分析，使用RDP classifier 贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析。基于OTU聚类分析结果，对各个样本进行多种多样性指数分析，包括物种累积曲线、Shannon指数和Chao1指数，并对测序深度进行检测；应用UniFrac软件PCoA分析中的两种度量方法，unweighted unifrac和weighted unifrac对样本进行聚类分析，比较不同样本间的进化距离。

2 结果

2.1 马来熊粪便菌群结构分析

共分析来自3只马来熊个体的粪便样本DNA，进行Illumina Miseq双末端测序(pair-end sequencing)。每个粪便样本菌群在物种分类水平上(门、纲、目、科、属)的分布情况有差异(表2)，在物种多样性水平上：LS02>LS01>LS03。

表2 马来熊粪便菌群的分类组成

Tab.2 Classification of the fecal microbes of sun bears

在“门”的水平上，3个粪便样本中包含一个古菌门(Crenarchaeota)、少量尚未确定系统地位的细菌(Unclassifid)和15个细菌菌门(表3)。

15个菌门按照所占比例的大小排序，分别是厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)、蓝藻菌门(Cyanobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、未定门、疣微菌门(Verrucomicrobia)、异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)、衣原体门(Chlamydiae)、绿弯菌门(Chloroflexi)、浮霉菌门(Planctomycetes)、互养菌门(Synergistetes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)。其中有7个菌门是3只马来熊粪便样本中共有的：厚壁菌门(54.70%)、变形菌门(41.90%)、梭杆菌门(1.80%)、蓝藻菌门(0.70%)、放线菌门(0.20%)、拟杆菌门(含量少)、未定门TM7(含量少)。每个菌门在3只马来熊粪便中的含量有差异。其余8个菌门仅分布于部分样本，且所含的序列数很少。上海动物园圈养马来熊冬季肠道菌群以厚壁菌门、变形菌门和梭杆菌门为主要优势菌门(表3)。

表3 马来熊粪便微生物在门水平上的分类组成

Tab.3 Classification of fecal microbe in feces of sun bears at phylum level

注：Total为3个样品的菌群丰度平均值；0.00表示该菌门所占的比例很低，但不是0

Notes：Total indicates mean value of microbes fecundity.0.00 indicates low percentage but not zero

(1)厚壁菌门

3个粪便样本中检测出的该菌门最多，占总序列的54.70%。该菌门中的优势菌群按序列多少排列为芽孢杆菌纲(Bacilli)、梭菌纲(Clostridia)和丹毒丝菌纲(Erysipelotrichia)。其中芽孢杆菌纲包含乳杆菌目(Lactobacillales)和芽孢杆菌目(Bacillales)，乳杆菌目为优势菌群，该目中链球菌科(Streptococcaceae)和肠球菌科(Enterococcaceae)的菌群为优势菌群，链球菌科中的链球菌属(Streptococcus)为优势菌群，肠球菌科中绝大多数为肠球菌属(Enterococcus)。梭菌纲中的梭菌目为优势菌群，该目中主要以消化链球菌科为主，该科中的梭菌属(Clostridium)含量最多。

(2)变形菌门

检测出该菌门占总检出序列的41.90%。主要以变形菌纲(Gammaproteobacteria)为主，该纲中多归属于巴斯德菌目(Pasteurellales)、肠杆菌目(Enterobacteriales)和假单胞菌目(Pseudomonadales)，巴斯德菌目中仅有1个巴斯德菌科(Pasteurellaceae)，该科中大部分菌群未鉴定到属。肠杆菌目中以大肠杆菌-志贺菌属(Escherichia_Shigella)为优势菌群。

(3)梭杆菌门

梭杆菌门仅包含1个梭杆菌目(Fusobacteriales)，该目中包含梭杆菌科(Fusobacteriaceae)和纤毛菌科(Leptotricheae)两科，其中，梭杆菌科为优势菌群，该科中的醋酸杆菌属(Cetobacterium)及梭杆菌属(Fusobacterium)为优势菌群。

(4)其余菌门

蓝藻菌门仅包含一个蓝藻纲(Cyanophyceae)。放线菌门主要以棒状杆菌属(Corynebacterium)为主；拟杆菌门主要以鞘壁醇杆菌属(Sphingobacterium)为主。

测定的3个粪便样品中，能够确定到属的序列占69.0%。3个样品一共含有不重复的细菌265属，其中只有127属是3个样品共有的，每个样品都存在特有属。在属多样性水平上：LS02>LS01>LS03(图1)。含量大于1%的菌属有7种，其中链球菌属最多(23.2%)，其次是大肠杆菌/志贺菌属(14.8%)和梭状杆菌属(12.1%)。含量大于1%且小于10%的菌属包括：图利茨菌属(Turicibacter)(6.4%)、梭菌属(9.1%)、 肠球菌属(1.6%)和醋酸杆菌属(1.8%)。

2.2 马来熊粪便菌群多样性比较

基于每个粪便样本的OTU数量和指数分析，发现observed_species(图2a)、 Chao1(图2b)曲线图比较一致均显示LS02在样本量达到一定数量后会越过LS03和LS01，达到最高，与OUT分析结果及物种种类统计结果一致，LS02样本物种丰富度最高，其次为LS01、LS03，但shannon曲线显示与该结果不一致(图2c)。

2.3 菌群聚类分析

unweighted unifrac和weighted unifrac聚类分析结果均显示，LS01和LS02的肠道菌群进化距离最近，LS03和LS02的进化距离最远(表4)。

图1 马来熊粪便微生物在属水平上的分布韦恩图Fig.1 Wayne distribution of microbes in the feces of sun bears at genus level

表4 马来熊粪便微生物的聚类分析的距离矩阵(weighted 和unweighted)

Tab.3 Distance matrix for cluster analysis of fecal microbes of sun bear(weighted and unweighted)

注：*weighted.**unweighted

图2 3只马来熊粪便样本中菌群丰度曲线Fig.2 Microbe fecundity in the feces of 3 sun bears 注：a.Observed species曲线；b.Chao1曲线；c.Shannon曲线 Note：a.Observed species curve.b.Chao1 curve.c.Shannon curve

3 讨论

细菌16S rRNA片段长度适中，有多个区段高度保守信息量较大易于分析。根据保守区域，可以设计出通用引物，用来扩增出群体中所有细菌的16S rRNA片段，也可以通过可变区的差异来分不同的菌种。本研究在Miseq平台的2×250 bp测序基础上，测定16S rDNA V4区的方法对马来熊的肠道菌群进行检测，借助通用引物深度测序，能有效覆盖16S rRNA的单一可变区(V4，一般为300—400 bp左右)，发现低丰度细菌和未知细菌，进而可全面、准确地获得粪便中菌群的信息。

在“门”的水平上，在马来熊粪便中发现15门菌群，一个古菌门及少量尚未定分类地位的细菌(Unclassified)，尽管这些尚未定分类地位的细菌含量较少，不足0.05%，但这些新发现可以对马来熊肠道菌群的后续研究做出重要的补充。通过比较，马来熊粪便菌群结构与其他很多哺乳动物物种基本一致，粪便样本菌群均以厚壁菌门、变形菌门和梭杆菌门为优势菌门[3，52]。大熊猫与马来熊同属食肉目(Carnivora)，但主食竹子，在其粪便中发现菌群归属于6个门，其中没有未定门及放线菌门，取而代之的是酸杆菌门(Acidobacteria)[17]，其前4个优势菌门和马来熊一致。黑熊(Ursusthibetanus)的肠道菌群中共鉴定归类有12个“门”的微生物，包括厚壁菌门、变形菌门和梭杆菌门等。人的肠道可以划分出20个“门”的菌群，具有更高的多样性，但需要说明的是，人的肠道菌群仍然是以厚壁菌门和变形菌门为主[53-54]。狼和虎都属于食肉目的纯肉食性动物，研究表明，狼的肠道菌群归属于5个门，没有蓝藻菌门和未定门[15]，虎的肠道菌群归属于6个门，其中没有蓝藻菌门[55]。同杂食性动物相比，纯食肉的狼和虎肠道中的菌群门类较少，肠道菌群多样性较低。马来熊粪便菌群中以“属”为分类等级的菌群为链球菌属含量最多，其次是大肠杆菌/志贺菌属和梭状杆菌属，大熊猫粪便中的优势菌属依次为梭状杆菌属、大肠杆菌/志贺菌属和和图利茨菌属[21]；北极熊(Ursusmaritimus)、灰熊(Ursushorribilis)、黑熊的肠道菌群中的优势菌群为肠杆菌属、肠球菌属和肠杆菌科、肠球菌属和梭菌属[56]，物种的不同可能是造成以上同科动物肠道菌群差异的主要原因。此外，野生动物肠道中的菌群还会受到饮食[57]、个体[18]、年龄[1，58]、环境[59]、季节[60]等多方面的影响。

哺乳动物肠道菌群与动物的营养和消化有密切关系，表现在合成宿主所需的维生素、参与糖、淀粉和脂肪的代谢等[61]。大熊猫可以编码肉食动物消化系统所需要的酶，但缺少消化纤维素的酶的编码基因，而其体内存在与纤维素、半纤维素、木质素消化相关的菌群，包括：梭菌属、肠球菌属、明串珠菌属(Leuconostoc)和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)等[17]。马来熊为杂食性动物，其肠道内发现与纤维消化相关的菌群：梭菌属、肠球菌属、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属、假单胞菌属、图利茨菌属 、鞘氨醇单胞菌属和拟杆菌属；研究表明，熊类的肠道中有纤维消化相关的菌群，但这些菌是长期定植在肠道中的或是过路菌，尚不明确，需要进一步研究。本研究中，圈养马来熊的日粮及饲养环境等会直接影响其肠道菌群结构，但这些因素到底如何影响动物粪便菌群的结构组成仍然是未解之谜，部分原因是这些因素常常互相关联，所以无法确定到底是那个因素导致了肠道微生物结构的变化[62]。基于此，田银平对肠道菌群与动物食性之间的相互作用提出相反的观点，即动物食性的变化也可能是由其肠道菌群的变化而引起的[55]。多样化的菌群首先在动物肠道内定植，为动物食性的转变提前做好准备，进而保证动物发生食性转变时能够在生理上适应，并存活和遗传下来。

哺乳动物自出生时起，胃肠道开始有外来微生物栖息并定植，肠道菌群逐渐形成，并随着宿主生长发育而不断发生动态变化[63]。研究表明，宿主的性别和年龄是决定肠道菌群组成的重要因素之一[1，64-66]。对不同年龄段川金丝猴(Rhinopithecusroxellana)的肠道菌群的研究结果表明，川金丝猴肠道菌群的多样性与优势菌群数量伴随年龄增长不断变化，其肠道菌群多样性呈增加到减少的一个趋势，而优势菌群的数量变化不一致，有的呈增加的趋势，有的呈减少的趋势[67]。本研究中，3只马来熊的粪便样本中的优势菌门一致，但同一菌门在不同个体粪样中的含量不同；在纲、目、科、属水平上的菌群数量、种类及丰度也存在差异，3个粪便样品都存在特有属，每只马来熊粪便菌群的多样性也不同，说明马来熊粪便菌群存在个体差异，且具有个体特异性。哺乳动物肠道菌群组成随着宿主的不同而发生变化[68]，由于取样的3只马来熊在日粮和饲养环境上相同，我们认为年龄很可能是导致本实验结果的主要因素，此外动物个体的生理状态等也有可能对粪便菌群造成影响，当动物生理状态和所处环境发生变化，肠道菌群也会产生动态变化，但菌群依然会向平衡方向发展[68]。

致谢：本研究完成过程中，得到东北林业大学野生动物自然保护地学院田秀华教授的大力支持，在此表示衷心感谢。