甲状腺乳头状癌组织miR-129 表达与临床病理特征的相关性

李 滢 刘 芳 冯 利 陈 双

甲状腺癌是内分泌系统最常见的头颈部肿瘤。甲状腺癌的病理类型包括乳头状癌、未分化癌、髓样癌及滤泡状癌，其中甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常见的恶性肿瘤，占甲状腺癌的70%左右[1]。尽管多数患者预后良好，但是仍有一部分PTC 出现高侵袭、早期转移[2]。因此，开展PTC 相关分子标志物的研究，为临床早期诊断和治疗预后提供新的方法一直是临床上的研究热点。目前普遍认为，由正常细胞转变为癌细胞，累及周围组织器官或发生远处转移是一个及其复杂的基因变化[3]。微小RNA-129（miR-129）是一种内源性单链非编码的小RNA 分子，有调控细胞的生长、分化、增生和凋亡的作用[4]。近年研究发现，miR-129 在结直肠癌、前列腺癌等中呈低表达[5-6]。本研究旨在分析miR-129 在PTC 组织表达及其与临床病理特征的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2010 年11 月—2014 年2 月浙江省台州恩泽医疗中心（集团）路桥医院收治的PTC 患者125 例作为研究对象，其中男32 例、女93例，年龄20～75 岁，平均（40.36±8.42）岁。病理分级和临床TNM 分期参照国际抗癌联盟第6 版甲状腺癌分期分级标准[7]：1 级77 例、2 级48 例；临床TNM 分期：Ⅰ期24 例、Ⅱ期51 例、Ⅲ期35 例、Ⅳ期15 例。本研究经医院伦理委员会审核通过。患者均知晓本研究内容并签署知情同意书。

1.2 纳入标准（1）均符合国际抗癌联盟第6 版甲状腺癌分期分级标准；（2）均进行全甲状腺切除+患侧中央区淋巴结清扫；（3）均经术后病理学确诊。

1.3 排除标准（1）有严重肝肾功能不全者；（2）合并其他恶性肿瘤者；（3）入院前经过放疗或化疗等治疗者；（4）临床及随访资料不完整者。

1.4 标本采集 选取125 例PTC 并行手术治疗患者，收集PTC 癌变组织125 份作为研究组，另在手术过程中收集125 份距离癌组织边缘5cm 以上正常甲状腺组织为对照组，两组组织标本均进行miR-129水平的检测。

1.5 定量聚合酶链反应（qPCR）检测甲状腺乳头状癌组及癌旁组织miR-129mRNA 表达 采用TRIzol[赛墨飞世尔科技（中国）有限公司，批号ab49534]提取0.3g 甲状腺癌组织及癌旁组织总RNA。使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis 试剂盒（美国Life Technologies 公司，批号C120835）产生第一链互补（c）DNA。使用GAPDH 进行标准化（GAPDH 正向引物5'-CTCGCTTCGGC-AGCACA-3'；反向5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'）。PCR 引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司提供并合成，序列如下：miR-182 正向引物：5'-CTTGCTATACAAGGGCAAGCACGAA-3'，反向引物：5'-CTTGAGTACGACCAAATCCCGTC-3。具体操作：将2μL RNA 与1μloligo（dT）和10μL 无RNase 的去离子水混合，在PCR 机中在70℃下孵育5min 并立即在冰上冷却。通过加入4μL 5X 缓冲液，2μL 10mM 脱氧核糖核苷酸三磷酸，1μL RNA 抑制剂和1μL 逆转录酶诱导cDNA 合成，然后在PCR 机中于42℃温育1h。通过在70℃温育5min 终止反应。使用THUNDERBIRDS YBR qPCR Mix 试剂盒（日本Toyobo Co，Ltd，Tokyo，Japan公司，批号6514）进行定量测量。对于PCR，将12.5μL 2XqPCR Mix，2.0μL 每 种 引 物（2.5μM），2.0μL cDNA 和8.5μL 双蒸水加入0.2mL PCR 管中。扩增条件包括40 个循环，95℃，15min，95℃，15s，55℃，30s，72℃，25s。然后将反应保持在4℃。使用阈值循环（Ct）的值确定每个靶基因的mRNA 表达。在与GAPDH 比较后使用2-ΔΔCT 方法计算相对表达。

1.6 统计学方法 应用SPSS 20.0 软件进行数据统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t 检验，计数资料以率（%）表示，两组间采用χ2检验，采用Kaplan-Meier 法估计不同临床特征PTC 患者的生存情况，通过非条件单因素和多因素Cox 比例风险回归模型分析影响PTC 患者预后的相关因素，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组组织标本miR-129mRNA 表达水平比较PTC 患者其PTC 癌变组织miR-129 mRNA 表达水平低于癌旁正常组织[（0.66±0.21）比（1.89±0.48），P＜0.01]。

2.2 不同临床特征PTC 患者甲状腺癌组织miR-129 表达比较 根据ROC 曲线取miR-129 mRNA=0.49 时，约登指数最大为0.38。因此，miR-129 mRNA=0.49 时作为诊断PTC 的截点，miR-129 低表达患者（≤0.49）33 例（26.40%），miR-129 高表达患者（＞0.49）92 例（73.60%）。miR-129 的表达与PTC 患者其年龄、性别、肿瘤大小情况均无明显关系（P＞0.05），miR-129 的表达与PTC 患者临床分期、淋巴结转移及病理分级的表达有显著关系（P＜0.001、P＜0.001、P=0.018），见表1。

表1 不同临床特征的PTC 患者其miR-129 表达情况比较[例（%）]

2.3 PTC 患者预后生存情况 本研究125 例PTC患者中，自出院后至随访结束存活4～60 个月，5 年生存率50.40%（63/125）。其中miR-129 高表达和低表达患者5 年总生存率分别为72.73%（24/33）和42.39%（39/92），经统计学分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 影响PTC 患者预后的单因素分析 经单因素分析得出：临床分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移、病理分级2 级及miR-129 水平低表达时患者生存时间均显著缩短（P＜0.05），见表2。

2.5 影响PTC 患者预后Cox 多因素分析 经多因素Cox 比例风险回归模型分析得出：临床分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移、病理分级2 级及miR-129 水平低表达均为影响PTC 患者预后的独立危险因素（P＜0.001），见表3。

3 讨论

机体内的细胞因子和基因的表达与患者治疗及预后情况密切相关[8]，故寻找影响患者病情进展和预后的相关因素是改善PTC 患者预后的关键。miRNA是一类长度为20～24nt 的单链非编码微小RNA，广泛存在于动植物中。肿瘤细胞组织miRNA 基因的改变存在多样化，主要以基因缺失、过表达及基因扩增为主[9]。研究表明，miRNA 在细胞或组织中可充当抑癌基因或者促癌基因的角色，直接影响肿瘤的发生、发展[10]。相关研究证实，miR-34、miR-1301、miR-19等在PTC 异常表达，对PTC 患者造成严重影响[11-12]。

表2 影响PTC 患者预后的单因素分析

本组研究中，PTC 癌变组织miR-129 表达低于癌旁正常组织，患者临床分期越高、有淋巴结转移、病理分级越高其miR-129 低表达率明显升高，这提示miR-129 在机体中的表达与PTC 的发生和疾病进展有密切关系。于浩等[13]研究表明，miR-129 在膀胱癌组织呈低表达水平，且支持miR-129 可能成为膀胱癌诊断的无创肿瘤标记物，可用于早期诊断及预后判断和复发的预测。潘印等[14]研究显示，在前列腺癌患者，miR-129 在肿瘤低分化、病理分期越高中呈低表达。本研究结果与上述结果一致，进一步证实miR-129 参与肿瘤的发生、发展。多因素Cox 回归分析显示，临床分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移及病理分级2 级及miR-129 低表达均为PTC 患者预后独立危险因素（P＜0.05）。既往研究表明，张力蛋白同源的基因、人类第10 号染色体缺失的磷酸酶及程序性细胞死亡因子4、肌球蛋白1 等在恶性肿瘤形成过程中起重要作用的抑癌基因，均为miR-129 的下游靶基因，通过调控这些下游靶基因，进而调控这些因子所在的信号传导通路，从而在恶性肿瘤的发生和进展中起促进作用[15]。由此可见，miR-129 在PTC 患者疾病的发生、进展以及预后中有着重要的影响，因此，miR-129 可作为判断甲状腺乳头状癌临床病理特征及预后的生物标志物，临床上检测miR-129 表达水平，预测PTC 患者的预后情况。

表3 影响PTC 患者预后Cox 多因素分析

综上所述，在PTC 癌组织miR-129 以较低水平表达，随患者临床分期越高、有淋巴结转移、病理分级越高时其表达率均上升。miR-129 表达水平与肿瘤的进展程度和恶性程度呈负相关，miR-129 低表达PTC患者预后相对较差，检测miR-129 表达水平有利于PTC 的诊断及预后评价。但本组研究所选样本量较少及研究及随访时间过短，对于miR-129 的表达是否受其他因素影响尚未明确，需进一步深入研究。