普洱茶茶梗发酵香料制备及成分对比分析

丁讫　李源栋　刘秀明　夏建军　赵轶　李娟　杨义　段焰青

摘要：以普洱茶茶梗为原料，基于烟草中分离获得3株菌株发酵制备烟用香料。采用同时蒸馏萃取结合气相色谱-质谱联用技术对茶梗发酵香料进行提取分析，通过GC/MS成分分析发现发酵物中苯乙醇、植醇、棕榈酸等部分香气成分增加，并采用发酵物对卷烟进行加香评吸，发现对卷烟抽吸感官有着明显的提升。通过烟草分离出来的菌株能对茶梗进行很好的产香并改善卷烟感官品质，该文可为进一步研究发酵香料提供理论参考。

关键词：普洱茶茶梗;微生物发酵;烟用香料;感官评价

中图分类号：TS426 文献标志码：A 文章编号：1674-5124（2019）08-0067-08

0 引言

普洱茶是我国特产茶，主要产于云南勐海、勋腊、普洱市、耿马、沧源、双江、临沧、元江、景东、大理等地。普洱茶香气独特，并具有减肥、降血糖、降血脂、防癌、抗氧化等保健功效[1-4]。普洱茶根據不同加工工艺分为生茶和熟茶，握堆发酵利用其中酶促、微生物和湿热作用使普洱茶发生一系列物理化学变化，改变茶主要成分产生不同特色香味[5-8]。据报道，茶叶中许多香气成分与烟草中的相同或相似;因此，本文通过从烟叶中分离出的菌株对茶叶进行发酵试验，将茶叶提取液作为卷烟添加剂，可与烟香谐调，弥补烟香，增加卷烟烟气香气量，提高香气质，改善抽吸品质，并在一定程度上降低卷烟烟气有害成分[9-11]。茶梗是茶加工过程产生的大量茶废弃物，并未得到充分利用[10]，目前利用微生物发酵技术开发烟用香精香料在烟草行业已有较为广泛应用，本文拟通过普洱茶茶梗与烟叶中微生物进行发酵制备香料，采用同时蒸馏萃取-气相色谱质谱联用法（SDE-GC/MS）对不同微生物发酵香料成分进行对比分析，并进行卷烟添加实验，评价其应用效果，实现对普洱茶茶梗综合利用，变废为宝。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

普洱茶茶梗，购于市场;枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis（Van3，保藏号：CGMCC No.4091），短小芽孢杆菌Bacillus pumilus（Van35，保藏号：CGMCCNo.3411），长孢洛德酵母Lodderomyces elongisporus（OF-08，保藏号：CGMCC No.6645），3种菌株均收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心;二氯甲烷，GR级，由百灵威科技有限公司提供。

1.1.2 仪器与设备

Agilent7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪+自动进样器（美国安捷伦科技有限公司）;万分之一电子天平（瑞士Mettler Tloede公司）;10mL移液器（德国Eppendorf公司）;粉碎机（上海比朗制造有限公司）;同时蒸馏提取装置;Milli-Q型超纯水机（美国Milli-pore公司）;BUCHI R-215型旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司）等。

1.2 方法

1.2.1 发酵处理

选取800g普洱茶茶梗放入粉碎机粉碎，将样品粉末分成4份，每份200g，放入4个2L的锥形瓶中，加入1L的超纯水，用密封膜密封放入灭菌锅，在121℃的条件下灭菌0.5h。其中一个锥形瓶为空白，另外3个分别接种3种不同的菌株。将V35（短小芽孢杆菌）、V3（枯草芽孢杆菌）、OF-08（长孢洛德酵母）菌种活化培养成种子液（OD600为18～2.0）并在无菌实验台进行接种，接种量按质量比为2%，150r/min、37℃条件下摇床培养5d，过滤获得到普洱茶茶梗发酵液[11-13]。

1.2.2 发酵香料制备

将普洱茶茶梗发酵液中加入400mL体积分数为80%的乙醇进行加热回流提取2h后过滤，重复3次，将3次滤液合并，静置1d取上清液。用旋转蒸发仪于60℃蒸馏除去乙醇，留下所得物再用200mL的95%乙醇静置1d，取上清液并在60℃下减压浓缩，得到发酵香料[14]。

1.2.3 同时蒸馏萃取

将普洱茶茶梗发酵香料50g加入同时蒸馏萃取装置一端的1L圆底烧瓶中，加入500mL超纯水、1mL内标溶液（质量浓度为50μg/mL萘溶液）及少许沸石，采用电热套在110℃下进行加热;装置另一侧是盛有50mL二氯甲烷的圆底烧瓶，在50℃下水浴加热，同时蒸馏萃取4h。将二氯甲烷溶液收集并用无水硫酸钠干燥12h，除去水分后过滤，将滤液减压浓缩至1mL，待GC-MS分析[14]。

1.2.4 色谱质谱分析方法

色谱条件。DB-5M毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm），载气为氦气（纯度为99.99%），流量：1.0mL/min。升温程序：初始温度50℃，保持2min;以3℃/min的速率升温至180℃;再以10℃/min的速率升温至230℃，保持10min。进样口温度：250℃，进样量：1.0μL，分流比：20：1，溶剂延迟6min。

质谱条件。离子源：电轰击电离（EI）源;离子源温度：230℃;四极杆温度：150℃;电离能量：70eV;传输线温度：280℃;扫描范围（m/z）：40～450，质谱检索图库：NIST谱库。

1.2.5 定量方法

采用GC-MS测定3种菌株发酵普洱茶茶梗香料中挥发性化学成分，通过Nist11图库进行检索确定其组分，扣除柱流失和溶剂残留，利用内标法确定各组分的相对含量。半定量计算目标物相对含量。方法如下：使用二氯甲烷作为溶剂配制50μg/mL萘溶液作为内标液[15]。分别称量50g不同菌株发酵香料同时蒸馏萃取，加入1mL内标液，测得内标物和目标物的峰面积，通过下式计算得到目标物相对含量[14]：

C_目标=C_内标×A_内标/50×A_内标

式中：C_目标——目标物质量浓度，μg/g;

C_内标——内标物浓度，mg/L;

A_内标——内标物峰面积;

A_目标——目标物峰面积。

2 结果与分析

2.1 普洱茶茶梗发酵香料成分分析

3种不同的菌株发酵及空白对照，通过GC-MS检测得出总离子流色谱图见图1～图4，通过计算分析得出各组分含量，结果如表1所示。

从表1可知，未发酵茶梗香料中鉴定出42种化合物，包括醇类11种、醛类4种、酉旨类5种、酚类5种、酮类6种、酸类3种、其他化合物8种，主要成分为糠醇（43.03μg/g），植醇（40.29μg/g），芳樟醇（37.24μg/g），α-松油醇（27.67μg/g），棕榈酸（20.64μg/g），香叶醇（17.77μg/g），苯乙醛（11.02μg/g），橙花醇（10.54μg/g）等;V35发酵茶梗香料中鉴定出52种化合物，包括烯烃类2种、醇类16种、醛类4种、酯类4种、酚类5种、酮类8种、酸类5种、其他化合物8种，主要成分为植醇（61.30μg/g），棕榈酸（56.35μg/g），芳樟醇（54.01μg/g），糠醇（53.97wg/g），α-松油醇（42.69μg/g），香叶醇（27.04μg/g），苯乙醛（15.17μg/g），橙花醇（13.78μg/g）等;V3发酵茶梗香料中鉴定出化合物60种，包括醇类15种、醛类4种、酯类5种、酚类6种、酮类10种、酸类10种、其他化合物10种，主要成分为棕榈酸（89.38μg/g），植醇（80.94μg/g），糠醇（77.31μg/g），芳樟醇（62.91μg/g），α-松油醇（48.10μg/g），香叶醇（33.43μg/g），咖啡因（23.40μg/g），橙花醇（16.80μg/g）等;OF-08发酵茶梗香料中鉴定出48种化合物，包括烯烃类1种、醇类12种、醛类5种、酯类8种、酚类5种、酮类5种、酸类5种、醚类1种、其他化合物6种，主要成分为苯乙醇（536.95μg/g），植醇（69.82μg/g），芳樟醇（54.99μg/g），α-松油醇（42.50μg/g），棕搁酸（40.17μg/g），咖啡因（19.60μg/g），橙花醇（17.09μg/g），2，3-二氢苯并呋喃为（13.88μg/g）等。

通过采用不同菌株对普洱茶茶梗进行发酵处理，相比于空白，不同的菌株发酵后产生的香味成分种类和数量都存在一定差异，其特征主要香味成分含量存在明显变化，导致不同的香气及效果，给卷烟加香产生不同评吸感受。其中植醇具有细腻的花香和膏香，其含量增加52.14%～100.89%;棕榈酸具有淡淡的蜡味、增加口感，其含量增加94.62%～333.04%;芳樟醇具有花香、木香、微弱的柑橘香及花甜香味，其含量增加45.03%～68.93%;糠醇具有微弱的发酵香、焦糖香、奶油味和焦甜味，其含量增加25.42%～79.66%;α-松油醇具有微弱的发酵香、焦糖香、奶油味和焦甜味，其含量增加53.59%～73.83%;香叶醇具有甜香、玫瑰花香、水果味，其含量增加-69.61%～88-12%;苯乙醇具有玫瑰花香及花香味，其含量增加36.55%～1256.39%。

2.2 添加普洱茶茶梗发酵香料卷烟感官评吸结果

将三种菌株发酵香料分别取0.1g，用无菌水稀释40倍，均匀喷洒在40g烟丝上;用密封袋密封后在80℃烘箱中放置30min;以空白烟丝作为对照，将处理组和对照组的烟丝在温度22℃和相对湿度60%的恒温恒湿箱中平衡24h;按常规方法卷成烟支并随机编号后，由专业评吸人员进行感官评吸[16]。参照GB5606.4-2005《卷烟第四部分：感官技术要求》[17]对烟支样品进行感官评价（见表2）。评吸结果表明：相比对照，普洱茶茶梗发酵香料具有改善烟香、余味，增加甜润感、降低刺激，吸味更加柔和效果，明显提升了卷烟感官抽吸品质。

3 结束语

本文采用从烟叶中分离出来的3种菌株对普洱茶茶梗进行发酵制备香料，结合SDE-GCIMS对普洱茶茶梗发酵香料成分进行对比分析，其中从V35（短小芽孢杆菌）、V3淞草芽孢杆菌）、OF-08（长孢洛德酵母）普洱茶茶梗发酵香料中分别鉴定出52种、60种和48种化合物，不同菌株发酵普洱茶茶梗香料中成分含量以及种类有着明显差异。发酵后香气成分相对于未发酵有所增加，最为突出的是OF-08发酵物中苯乙醇相对于未发酵增加了1256.39%，试验证明OF-08（长孢洛德酵母）能发酵产生大量的苯乙醇。同时将3种不同发酵香料进行卷烟评吸，相比对照，普洱茶茶梗发酵香料具有改善烟香、余味，增加甜润感、降低刺激，使吸味更加柔和的效果，且不同菌株发酵普洱茶茶梗香料对卷烟抽吸品质改善效果不一样。本研究采用烟叶中分离出来的微生物对普洱茶茶梗进行发酵，产生了大量的致香物质，能很好的改善卷烟的抽吸感，并不會破坏原有的和谐及香气，且成本较低，安全性高，该方法在烟用香精香料中具有较好的工业应用前景。

参考文献

[1]MOK P，CHANG R C C，MINGFU W，et al.A review on thelaboratory investigations and epidemiological studies of blackand Puerh tea[J].ACS Symposium Series，2008，987：144-159.

[2]HUANG Q F，CHEN S，CHEN H，et al.Studies on thebioactivity of aqueous extract of Pu-erh tea and its fractions：invitro antioxidant activity and a-glycosidese inhibitoryproperty，and their effect on postprandial hyperglycemia indiabetic mice[J].Food and Chemical Toxicology，2013，53（3）：75-83.

[3]颜振敏，吴艳兵，冯俊旗，等.普洱茶挥发性成分的GC-MS分析[J].光谱实验室，2012，29（4）：2235-2237.

[4]周红杰，郭红芳，曾燕妮，等.陈香普洱茶品质特点分析[J].茶叶，2001，27（3）：31-34.

[5]龚淑英，周树红.普洱茶贮藏过程中主要化学成分含量及感官品质变化的研究[J].茶叶科学，2002，22（1）：51-56.

[6]任洪涛，周斌，夏凯国，等.不同发酵程度普洱茶香气成分的比较分析[J].食品研究与开发，2011，32（11）：23-26.

[7]陈保，徐明发，姜东华，等.不同普洱茶原料握堆发酵过程中香气成分的变化研究[J].食品安全质量检测学报，2018，9（2）：284-293.

[8]陈保，满红平，姜东华，等.顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法分析普洱茶握堆发酵过程中的香气成分变化[J].食品安全质量检测学报，2017，8（6）：2191-2198.

[9]倪跃新.铁观音茶叶挥发性致香物的制备及其在卷烟加香中的应用[J].香料香精化妆品，2012（3）：4-6.

[10]张维麟，李依蔓.茶叶渣对废水中Crb+和MnO，一的吸附效果研究[J].时代农机，2013，40（3）：220-223.

[11]杜雷，赵高岭，席宇，等.烟梗废料固态发酵生产苏云金芽孢杆菌的适宜条件筛选[J].烟草科技，2011，46（12）：75-78.

[12]李仙，董伟，段继铭，等.羊肚菌发酵烟草多糖及其在卷烟中的初步应用[J].中国烟草科学，2011，32（3）：36-40.

[13]李成斌，李仙，刘煜宇，等.葡萄发酵烟用香料的制备及挥发性成分分析[J].食品与生物技术学报，2012，31（8）：891-895.

[14]赵升逵，李源栋，王红霞，等.SDE/GC-MS分析烘烤葵花壳的挥发性成分[J].中国食品添加剂，2016（8）：177-184.

[15]蔣美红，包崇彦，念小魁，等.红茶烟用香料的制备、分析及应用[J].茶叶科学，2007，27（2）：117-119.

[16]李勇，王猛，陈剑明，等.出芽短梗霉OF-O1菌株的筛选及其在烟草香料中的应用[J].轻工学报，2017，32（4）：49-57.

[17]中国国家标准化管理委员会.卷烟第四部分：感官技术要求：GB5606.4-2005[S].北京：中国标准出版社，2005.

（编辑：莫婕）