49味中药及其复方与抗生素对溶藻弧菌的体外抑菌作用

徐晓津，李秀华，马一帆，李慧耀，祁 欣，陈郁浓，吕海龙，鄢庆枇

49味中药及其复方与抗生素对溶藻弧菌的体外抑菌作用

徐晓津1,2，李秀华3，马一帆4，李慧耀1,2，祁 欣1,2，陈郁浓1,2，吕海龙1,2，鄢庆枇1,2

（1. 集美大学 水产学院，福建 厦门 361021；2. 福建天马科技股份集团有限公司，福建 福州 350308；3. 厦门医学院附属第二医院中医科，福建 厦门 361021；4. 厦门大学海洋与地球学院，福建 厦门 361005）

筛选对溶藻弧菌（）有抑菌作用的中草药及其复方以及抗生素。采用改良的牛津杯法对诃子、白芍、甘草等49种单味中药进行溶藻弧菌体外抑菌试验，以体外抗菌活性较好的22种药物，按中药配伍规则组成二联、三联复方，采用生药质量浓度分别为60、240 mg/mL的中药进行中药复方体外抑菌试验。用抗生素对溶藻弧菌进行药敏试验。当单种中药体外抑菌药物质量浓度为240 mg/mL时，诃子、乌梅、醋五味子等对溶藻弧菌抑菌作用明显，为极敏感。在二联中药体外抑菌试验中，当中药质量浓度为60 mg/mL时，诃子、乌梅组成复方中药等8种复方对溶藻弧菌协同抑菌作用明显，为极敏感，药物质量浓度在240 mg/mL时，诃子与白芍等14种双联中药的协同抑菌作用明显，为极敏感。在三联中药体外抑菌试验中，在药物质量浓度60 mg/mL时，诃子、乌梅、蒲公英等组成24种复方中药按质量比1∶1∶1的抑菌效果极为敏感，药物质量浓度在240 mg/mL时，黄芩、诃子、黄芪等22复方中药按质量比1∶1∶1对的抑菌作用明显，为极敏感。溶藻弧菌对恩诺沙星、盐酸多西环素、土霉素及甲氧苄啶/磺胺甲噁唑4种药物高度敏感。18种单味中药对溶藻弧菌有抑制作用，黄芩、诃子、黄芪等24个三联复方中药药效较强，多个抑菌作用效果良好的三联复方中药可用于鱼病防治研究。

中药；抗生素；溶藻弧菌；抑菌作用

溶藻弧菌（）是鱼、虾、贝等海水养殖动物的条件致病菌，在我国南方沿海和台湾等地区，大黄鱼（）[1]、石斑鱼（）、卵形鲳鲹（)[2]、红笛鲷（）等重要经济鱼类易感染溶藻弧菌而发病，死亡率高，对石斑鱼的危害尤为严重[3]，患溶藻弧菌病的种类包括点带石斑鱼（）、青石斑鱼（）、鲑点石斑鱼（）和赤点石斑鱼（）等，主要表现为败血症、烂尾、烂鳃等症状，给水产养殖业带来较大经济损失[4-11]。在水产养殖中，抗生素和化学抗菌药广泛用于预防和治疗各种弧菌病，但随着抗生素的广泛应用，耐药性细菌不断出现，给治疗带来困难。中药治疗细菌性疾病有悠久的历史，有抗菌作用的中草药种类多，且有成本低、加工方便、抗菌性好、细菌不易产生耐药性、能增强鱼类免疫力等优点。国内学者已进行少数中草药饲料添加剂在水产养殖上的应用研究，但如何选择有效抗菌中药成为近年来研究的难点。本研究选用49种中药，通过溶藻弧菌体外中药单方和复方的体外抑菌试验，以及溶藻弧菌对抗生素药敏试验，筛选有较强抑菌作用的中药三联复方，探讨其对溶藻弧菌的抑制作用，为石斑鱼、大黄鱼等海水鱼细菌病治疗提供帮助。

1 材料与方法

1.1 供试菌种

溶藻弧菌菌液由集美大学水产学院国家海洋局渔用疫苗工程中心实验室制备、保存[12]。溶藻弧菌分离自患病石斑鱼，将溶藻弧菌分别用LB液体培养基培养，28℃下恒温培养8～12 h，取对数生长期的菌液。磷酸盐缓冲液（PBS）调整菌液浓度达OD值0.5 (含菌量约为108cfu/mL)，置于4℃冰箱内保存，备用。

1.2 中药对溶藻弧菌体外抑制试验

1.2.1 单方中药的选取与药液制备 选择水产养殖生产病害防治有关的49种中药进行溶藻弧菌体外抑菌试验。选用艾叶、鱼腥草、大黄、黄柏、黄连、黄芩、连翘、板蓝根、白茅根、苦参、金银花、栀子、蒲公英、地锦草、千里光、乌梅、槟榔、榧子、使君子、柴胡、青蒿、槐花、木香、贯众、炒川楝子、大蒜、螺旋藻、刺五加、黄芪、杜仲叶、穿心连、白芍、醋五味子、党参、刺五加、枸杞子、大蒜、甘草、地锦草、白头翁、五倍子、诃子、茯苓、钩藤、虎杖、柴胡、郁金、炒槐花、野菊花等中药颗粒剂（均由江阴天江药业有限公司生产）。所有中药配方颗粒由公司统一生产，生产过程包括药材的炮制、浓缩提取、制粒包装。颗粒剂可溶于水，并保持生药同样药性。将中药配方颗粒溶解于无菌蒸馏水中，于沸水中热浴30 min。每包药标注相当于生药材质量，据此对各种中药进行逐一换算浓度、稀释，将各中药颗粒剂配成相当于生药质量浓度分别为60、120、180 mg/mL的溶液。由于多数中药因浓度太低，药效不明显，抑菌圈较小，不利于各中药药效的筛选，因此配制相当于生药的质量浓度为240 mg/mL的中药颗粒剂溶液，较多药物对溶藻弧菌有体外抑菌效果，根据其抑制圈大小筛选有效药物。

1.2.2 复方二联中药的选取与药液制备 选择1.2.1中有体外抑制作用的18种中药：诃子、黄连、乌梅、大黄、黄柏、白芍、醋五味子、槟榔、栀子、青蒿、黄芩、连翘、炒槐花、木香、艾叶、炒川楝子、蒲公英、野菊花，根据药物的特性及养殖生产实践中复方中药治疗细菌病的研究报道，增加甘草、板蓝根、黄芪、贯众四种单味药，制定复方二联中药组合。复方中药（中药颗粒剂溶液）二联按质量比1∶1，中药最终相当于生药的质量浓度为60、240 mg/mL。

1.2.3 复方三联中药的选取与药液制备 按1.2.1方法选择22种单味中药配方颗粒，根据药物的特性及养殖生产实践中复方中药治疗细菌病的研究报道，制定复方三联中药（中药颗粒剂溶液），复方中药三联按质量比1∶1∶1，中药最终相当于生药的质量浓度为60、240 mg/mL。

1.2.4 单方、复方二联、复方三联中药体外抑菌活性的测定方法 用改良的牛津杯法对49种单方中药、复方二联中药、复方三联中药进行溶藻弧菌体外抑菌试验。在平板中倒入10 mL灭菌LB固体培养基，待凝固后，在每个培养皿中等距离放入4 个牛津杯，取15 mL的LB培养基混合均匀倒于平板上，待凝固后，取下牛津杯。制备菌悬液，将培养12 h的溶藻弧菌离心，去上清，用PBS重悬，调整(600 nm) = 0.4，取0.1 mL菌悬液滴入平板，涂布均匀，在1个孔中加入200 μL无菌水为对照，其他3个孔中加入含生药240 mg/mL的3种不同药液200 μL，置于28℃条件下恒温培养18 ~ 24 h，用SupcreG1菌落计数/筛选/抑菌圈测量联用仪（杭州迅数科技有限公司）测量抑菌圈大小，每个试验重复3次，计算抑菌圈直径平均值，根据抑菌圈直径判定其抑菌能力。判定标准：抑菌圈直径≥20 mm为极敏感；15 mm≤抑菌圈直径< 20 mm为高度敏感；10 mm≤抑菌圈直径< 15 mm为中度敏感；抑菌直径< 10 mm低度敏感或无效。

1.3 溶藻弧菌对抗生素药敏试验

用牛津杯法，对恩诺沙星（兴化市恒威生物技术有限公司）、盐酸多西环素（河南海天生物科技有限公司）、土霉素（河南佰吉特生物科技有限公司）、磺胺嘧啶(山东亚康药业股份有限公司)、氟苯尼考（上海瑞博丘生物工程有限公司）、硫酸新霉素（宜兴市苏亚达生物有限公司）、硫酸庆大霉素（青岛富坤兽药原料有限公司）、磺胺甲噁唑（广州骏杰生物技术有限公司）进行药敏试验，使用剂量参照WHO推荐的K-B纸片琼脂扩散法中相应的药物浓度[13]。将溶藻弧菌用8.5 g/L生理盐水稀释至1×108cfu/mL，分别取200 μL菌悬液均匀涂布于LB培养基平板，每个平板放置4个牛津杯，每个孔分别加入以上8种抗生素药液。28℃下恒温培养24 h后，并用前述SupcreG1菌落计数/筛选/抑菌圈测量联用仪测量抑菌圈大小，每个平板做3 个重复。根据CLSI M100的最新标准判定溶藻弧菌的敏感性[14]。

2 结果与分析

2.1 不同中药单方对溶藻弧菌的体外抑制效果

诃子、乌梅、醋五味子对溶藻弧菌抑菌作用较强，为极敏感。槟榔、木香、白芍、艾叶、栀子、黄芩、青蒿抑菌作用较明显，为高度敏感。连翘、大黄、黄柏、炒川楝子、蒲公英、炒槐花、野菊花抑菌效果为中度敏感。灭菌作用以诃子最强。鱼腥草、黄连、板蓝根、白茅根、苦参、金银花、栀子、地锦草、千里光、榧子、使君子、柴胡、槐花、贯众、大蒜、螺旋藻、刺五加、黄芪、杜仲叶、穿心连、党参、刺五加、枸杞子、大蒜、甘草、地锦草、白头翁、五倍子、茯苓、钩藤、虎杖、柴胡、郁金等33种中药对溶藻弧菌无抑菌效果（表1）。

2.2 不同复方二联中药对溶藻弧菌的体外抑制效果

在60 mg/mL的低药物质量浓度时，复方中药诃子+乌梅、黄芩+诃子、诃子+醋五味子、诃子+白芍、诃子+乌梅、乌梅+醋五味子、乌梅+白芍、黄芩+乌梅对溶藻弧菌的抑菌作用明显，为极敏感。选择协同增效的药物组合可增强疗效，二联中药的各味药用量较一联中药少，抑菌效果增强，如乌梅与板蓝根单味药60 mg/mL时无药效，但60 mg/mL二联中药有较强药效。复方中药黄连+诃子、黄柏+诃子、黄连+板蓝根、板蓝根+诃子抑菌为中度敏感。黄柏+黄连组成、黄连+醋五味子、黄柏+黄连、黄连+醋五味子、黄连+白芍、大黄+黄连、黄柏+板蓝根、黄芩+黄连、黄柏+白芍等10种复方中药无抑菌作用（表2），说明多种二联中药组合有拮抗作用，无药效。药物质量浓度为240 mg/mL时，以下14种复方双联中药对溶藻弧菌的抑菌作用明显，为极敏感（表3），药效从高到低分别是（诃子+白芍）、（诃子+乌梅）、（白芍+醋五味子）等。黄连+醋五味子等3种复方中药对溶藻弧菌的抑菌作用明显，为高度敏感，抑菌圈直径大于15 mm。槐花与大黄等六种复方中药抑菌效果为中度敏感。黄柏+黄连、槐花+大黄、大黄+黄连、黄柏+板蓝根、黄柏+白芍、黄芩+黄连、贯众+白芍、黄芪+白芍、黄芪+大黄、槐花+黄柏等组成29个复方中药无药效（表2、3）。相对于一联中药，二联中药各组合物中，有起协同增效的药物组合，也有起拮抗作用、降低药效的药物组合。

2.3 不同复方三联中药对溶藻弧菌的体外抑制效果

在60 mg/mL的低浓度药物时，诃子+乌梅+蒲公英、黄芩+诃子+黄芪组成复方中药等22种中药抑菌效果极为敏感，抑菌圈直径大于22 mm。黄连+诃子+黄芪、白芍+贯众+大黄、白芍+醋五味子+大黄等组成复方中药抑菌效果为高度敏感。大黄+栀子+白芍、大黄+黄芪+白芍等组成15种复方中药抑菌效果为中度敏感。以下11种复方中药无抑菌效果，包括黄连+醋五味子+黄芪、大黄+黄芪+白芍、黄连+白芍+黄柏、黄连+大黄+黄芪、黄连+连翘+黄芪等（表4）。

表1 240 mg/mL浓度单味中药对溶藻弧菌的抑菌作用

说明：+ + +，极敏感；+ +，高度敏感；+，中度敏感。

表2 60 mg/mL浓度二联中药对溶藻弧菌的抑菌作用

说明：+ + +，极敏感；+ +，高度敏感；+，中度敏感。

表3 240 mg/mL浓度二联中药对溶藻弧菌的抑菌作用

说明：+ + +，极敏感；+ +，高度敏感；+，中度敏感。

药物质量浓度在240 mg/mL时，以下24种复方中药对溶藻弧菌的抑菌作用明显，抑菌直径大于20 mm，为极敏感，包括黄芩+诃子+黄芪、乌梅+醋五味子+黄连等。13种复方对溶藻弧菌的抑菌作用较明显，为高度敏感，包括乌梅+板蓝根+黄连、乌梅+黄芩+黄连等。12种复方中药对溶藻弧菌的抑菌效果为中度敏感，分别为大黄+黄芪+白芍、黄柏+醋五味子+黄芪等（表5）。相对于一联中药、二联中药，抑菌作用强三联中药的复方总数增加较多，说明选择起协同增效的药物组合可增强疗效。

表4 60 mg/mL浓度三联中药对溶藻弧菌的抑菌作用

续表4（Continued）

说明：，抑菌圈直径Bacteriostatic circle diameter； + + +，极敏感；+ +，高度敏感；+，中度敏感。

表5 240mg/mL浓度三联中药对溶藻弧菌的抑菌作用

续表5（Continued）

说明：，抑菌圈直径Bacteriostatic circle diameter； + + +，极敏感；+ +，高度敏感；+，中度敏感。

2.4 抗生素药物敏感试验

表6可见，溶藻弧菌对恩诺沙星、盐酸多西环素、土霉素及甲氧苄啶/磺胺甲噁唑4种药物高度敏感。对硫酸新霉素、氟苯尼考2种药物中度敏感。对硫酸庆大霉素及磺胺嘧啶2 种药物耐药。

表6 溶藻弧菌对8种抗生素的药物敏感性

说明：S：高度敏感；I：中度敏感；R：耐药。

Note: S: Highly sensitive; I: Medium sensitivity; R: Resistant.

3 讨论

3.1 单味中药的抗菌作用

许多中药有显著的抗菌作用及广谱的抗菌活性，并用以治疗动物疾病。中药免煎配方颗粒已得到较广泛的运用，其抑菌效果好，可克服汤剂需要浸泡、煎煮、耗时、不易储存、不易定量等缺点，有较多优势[15-20]。同一种药物颗粒剂与水煎剂对同种菌的抑菌圈大小差异较小[21]。使用中药颗粒剂研究动物疾病防治还可避免研究人员的操作误差。因此，本研究选用中药颗粒剂进行溶藻弧菌体外抑菌试验。

在抑菌试验中，用改良的牛津杯法测定抑菌圈是测定药物效价和活性的通用方法，本研究的49 种中药对溶藻弧菌抑菌圈结果可靠：在中药质量浓度为240 mg/mL时，诃子、乌梅、醋五味子对溶藻弧菌抑菌效果为极敏感，以诃子灭菌作用最强；白芍、艾叶、黄芩等对溶藻弧菌抑菌效果为高度敏感；黄连、金银花、栀子、五倍子等33种中药无抑菌效果。其他学者亦有相似结果：黄连、黄柏、黄芩对鲍曼不动杆菌（）、铜绿假单胞菌（）、屎肠球菌（）抑菌效果最好，五味子、黄连、乌梅、黄柏、艾叶4 种药物对鸡源多杀性巴氏杆菌（）、嗜水气单胞菌（）有较强抑菌活性，黄芩、大黄、虎杖中药对猪源金葡菌（）有良好的抑菌活性[22]。五倍子、大黄、虎杖和黄芩单味药对养殖病鳗（）中的嗜水气单胞菌均有较好的抑菌作用，以黄芩抑菌效果最佳，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant, MRSA）、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌（）、肺炎克雷伯菌（）、鲍曼不动杆菌有一定的抑菌效果[23]。连翘对铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌亦有一定的抑菌效果[23]。曲径等[24]筛选出黄连、黄柏、艾叶对禽多杀性巴氏杆菌敏感。黄连、黄芩、连翘等对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌()、链球菌均有较强抑菌作用，黄芪等对金黄色葡萄球菌也有抑菌作用[25]，对于金黄色葡萄球菌，抑菌作用五味子＞黄芩＞黄连。实验手段、条件、所试细菌毒力的强弱、药物的采集部位、药物处理等对实验结果有一定影响。

3.2 中药复方的抗菌作用

由于中药复方由多种药构成，化学成分多样，合理的单味药配伍组成复方可协同增效，抑菌效果比单味中药更佳，可较好地治疗复杂疾病[25]。本研究中，在60 mg/mL的低药物浓度时，诃子+乌梅等组成8个复方二联中药对溶藻弧菌的抑菌效果为极敏感。诃子+乌梅+蒲公英等22种组成复方三联中药抑菌效果极为敏感。药物质量浓度为240 mg/mL时，诃子+白芍等14种复方二联中药对溶藻弧菌的抑菌效果为极敏感。24种三联中药对溶藻弧菌的抑菌效果为极敏感。相对于一联、二联中药，三联中药抑菌作用强的复方总数增加较多，说明选择有协同增效作用的药物组合能增强疗效。本研究中，五倍子、诃子等药物对溶藻弧菌有较强抑菌作用，与其他药物组成与二联复方、三联复方的抑菌作用显著增强，国内学者研究结果也表明复方中药对细菌有抑制作用：五倍子、地锦草、大黄、乌梅、诃子等药物对嗜水气单胞菌有较强抑菌作用，其中五倍子抑菌效果最佳，药效持久，为理想的抑菌药物。五倍子分别与黄连、诃子、大黄组成复方灭菌活性较强，复方抑菌效果较单味药有显著增强作用，说明合理的药物组合有协同增效作用。黄芩、黄连、诃子、大黄、五味子等对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、巴氏杆菌有较强灭菌作用，党参、黄芪对金黄色葡萄球菌抑菌作用不强[25]，复方中药不是每种单味药有效成分的总和，而是不同药物间有化学变化，产生新的物质，起协同增效作用[23]。单味中药与复方中药抑菌的有效成分、作用机理仍需进一步的深入研究。

3.3 抗生素对溶藻弧菌的抑制作用

为进一步进行抗生素与所筛选中药的联用研究，减少鱼病防治中的抗生素用量，本研究进行8种抗生素对溶藻弧菌的体外抑菌试验，以筛选对溶藻弧菌抑菌效果较好的抗生素。结果发现，溶藻弧菌对恩诺沙星、盐酸多西环素、土霉素及甲氧苄啶/磺胺甲噁唑4种药物高度敏感，对硫酸新霉素、氟苯尼考2种药物中度敏感。

目前，寻找敏感的抗生素仍是生产实践中溶藻弧菌病药物防治的方法之一。本研究中药与抗生素的体外抑菌研究结果可为有效治疗细菌性疾病提供依据。在治疗中使用抑菌效果好药物，可达到减少使用剂量，为水产养殖业健康发展提供帮助。

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In Vitro Bacteriostasis of 49 Kinds of Chinese Herbs, Antibiotics and Their Compound Prescriptions Against

XU Xiao-jin1,2, LI Xiu-hua3, MA Yi-fan4, LI Hui-yao1,2, QI Xin1,2, CHEN Yu-nong1,2, LÜ Hai-long1,2, YAN Qing-pi1,2

（1.,,361021,; 2...,350308,; 3.,361021,; 4.,,361005,）

To screen out the Chinese herbs, antibiotics and their compound antibacterial activity againstFifty Chinese herbs including,Pall, and, etc. were employed to test their antibacterial effect onandby using improvedtests. Then the herbs that had the optimal effect were chosen to compose as the combination compounds prescription to compare their antibacterial activity. The concentrations of Chinese medicines were 60, and 240 mg/mL, respectivelyEach experiment was repeated 3 times. 8 antibacterial drugs againstwere tested.and(Turcz.) Baill etc had obvious inhibitory effect. The concentrations of Chinese medicines were 60 mg/mL, and 8 compound prescriptions, such asandhad obvious inhibitory effect. Fourteen compound prescriptions, such asandPallhad obvious inhibitory effect at a concentration of 240 mg/mL. 24 compound prescriptions, such asandhad obvious inhibitory effect at a concentration of 60 mg/mL. Twenty two compound prescriptions, such as,andhad obvious inhibitory effect at a concentration of 240 mg/mL.were susceptible to enrofloxacin, oxytet racycline, oxytetracycline, and trimethoprim.Eighteen Chinese drugs had inhibitory effect, 2compound prescriptions such ashad obvious inhibitory effects. Traditional Chinese herbal medicine (TCHM) formulas and TCHMformulas combined with antibiotics could be used for preventing the diseases outbreak in.

quantitative Real-time PCR；reference gene；

S948；S941.42

A

1673-9159（2019）06-0030-09

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.06.005

2019-07-01

国家自然科学基金（31702384、31502194）；福建省科技重大专项（2016NZ0001-3）；2018年开放课题基金项目（LYC2018RS04，闽海鸥[2018]31号）；福建省自然基金项目（2018J01455）；2017年集美大学研究生教育教学改革研究项目（集大研No.［2017］18号）；教育部鳗鱼工程研究中心开放基金项目（RE201704）

徐晓津（1969―），女，副教授，博士，研究方向为水产微生物学。E-mail: xiaojinxu@jmu.edu.cn

鄢庆枇（1971―），男，教授，博士生导师，研究方向为水产微生物学。E-mail: yanqp@jmu.edu.cn

徐晓津，李秀华，马一帆，等. 49味中药及其复方与抗生素对溶藻弧菌的体外抑菌作用[J]. 广东海洋大学学报，2019，39（6）：30-38.

（责任编辑：刘庆颖）