黑豆皮多酚提取物抗氧化活性研究

任曼妮 王存堂 唐旭华 孙 鹏 高曾明

(齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

黑豆是一年生草本豆科植物，原产于中国东北三省、安徽、河南、河北、山东等。其形状多呈扁圆、长椭圆形或肾状形。黑豆作为药食两用物质，历史久远[1]。黑豆营养物质丰富，被誉为“植物蛋白之王”[2]。此外，黑豆还富含植物活性物质，具有比其他可食用豆类更高的酚类物质和抗氧化性[3]，且这些酚类物质多集中在黑豆皮中[4]。

Xu等[5]通过HPLC从黑豆中分析出12种异黄酮类化合物；Feng等[6]通过HPLC从黑豆中鉴定出4种异黄酮；Lee等[7]分析了黑豆中花青素的组成。研究[5,8]表明，黑豆皮所富含的酚类化合物使得黑豆比其他豆类具有更高的自由基清除能力和总抗氧化能力。黑豆皮中的酚类物质具有很多生物活性，如抗辐射、抗氧化、抗脂肪和降血脂、降血糖、促进伤口愈合、抗炎等。Kwon等[9]通过高脂肪喂养小鼠，表明黑豆皮提取物可以转变高脂肪饮食对体重、血清脂质的影响；Wang等[10]通过建立高血糖小鼠模型，证明了黑豆皮提取物具有改善氧化应激诱导的小鼠高血糖症状。此外，Nizamutdinova等[11]发现黑豆皮提取物对伤口愈合有促进作用。

试验拟以黑豆皮为原料，分别利用体积分数70%的甲醇、乙醇和丙酮作为提取溶剂进行多酚类物质提取，测定提取物中总酚、总黄酮含量及抗氧化活性，为黑豆营养功能的深度开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

黑豆皮：市售，粉碎，过 80 目筛备用；

ABTS、DPPH：分析纯，美国 Sigma-Aldrich化学试剂公司；

没食子酸标准品、芦丁标准品、Folin-酚试剂、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、碳酸钠、丙酮、甲醇、乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、硫酸亚铁、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁：分析纯，天津凯通化学试剂公司。

1.1.2 仪器与设备

电子分析天平：ME204型，梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司；

高速万能粉碎机：FW100型，天津市泰斯特仪器有限公司；

紫外—可见分光光度计：UV-5100型，上海元析仪器有限公司；

高速离心机：LG10-24A型，北京京立离心机有限公司；

数显恒温水浴锅：HH-6型，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；

旋转蒸发仪：RE-200A型，上海亚荣生化仪器厂；

真空冷冻干燥机：LGJ-25C型，北京四环科学仪器厂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黑豆皮多酚类物质的提取 称取0.5 g黑豆皮粉，分别用20 mL体积分数为70%的乙醇、甲醇、丙酮避光震动提取20 min，6 000 r/min离心10 min，取上清液。沉淀用同样的方法再次提取，合并两次所得上清液，50 ℃真空下浓缩2 h，再转至-40 ℃真空干燥48 h。粉末于-20 ℃密封储存备用。按式(1)计算多酚物质得率。

(1)

式中：

c——多酚物质得率，g/100 g；

m1——提取物干粉质量，g；

m2——黑豆皮干粉质量，g。

1.2.2 总酚含量测定 采用福林酚法，参考Xue等[12]方法并稍作修改。取0.15 mL提取液稀释至0.1 mg/mL，于10 mL具塞比色管中，加入10倍稀释的0.2 mol/L福林酚试剂，利用涡旋混匀器混匀，静置5 min。然后加入6%(体积分数)Na2CO3溶液1.5 mL，将此混合液于75 ℃下水浴10 min，随后立即冰浴终止反应，用蒸馏水定容至刻度。于725 nm处测定反应液吸光值。同时以0.15 mL甲醇代替提取液作空白对照，配置不同浓度梯度没食子酸标准品制作标准曲线(y=0.031x+0.013，R2=0.998)。总酚含量以每克黑豆皮提取物干基中所含没食子酸当量的毫克数表示，重复测定3次。

1.2.3 总黄酮含量测定 参考Zhang等[13]的三氯化铝分光光度法略加改动。取1 mL提取液稀释至0.1 mg/mL，于10 mL具塞比色管中，加入5 g/L NaNO2溶液0.3 mL摇匀，静置6 min后再加入10 g/L AlCl3·6H2O溶液0.3 mL，静置6 min。加入10%(质量分数)NaOH溶液4.0 mL，用蒸馏水定容，静置15 min，于510 nm下测其吸光值。同时以1 mL甲醇代替提取液作空白对照，配置不同浓度梯度芦丁标准品制作标准曲线(y=1.016x-0.012，R2=0.998)，总黄酮含量以每克黑豆皮提取物干基中芦丁当量毫克数表示。重复测定3次。

1.2.4 DPPH自由基清除性能测定 参考Bakar等[14]的方法并略有改动。吸取0.4 mL不同浓度(0.012 5～0.200 0 mg/mL)提取液于试管中，再加入0.1 mmol/L DPPH甲醇溶液4.5 mL (Abs为1.00±0.02，临用现配)，充分摇匀后避光反应30 min，以甲醇代替样品提取液为空白调零，517 nm下测定吸光度值，配置不同浓度的抗坏血酸(0.012 5～0.200 0 mg/mL)作为阳性对照。按式(2)计算DPPH自由基清除率[15]。

(2)

式中：

k——自由基清除率，%；

A2——对照组吸光度值；

A1——样品组吸光度值。

1.2.5 ABTS自由基清除性能测定 参考Re等[16]和李青等[17]的方法并略有改动。将7 mmol/L ABTS水溶液与2.45 mmol/L过硫酸钾溶液混合，避光放置12～16 h，形成ABTS+自由基储备液。用无水乙醇稀释，734 nm下调其吸光度为(0.700±0.020)，得ABTS+自由基工作液，于30 ℃下储存备用。吸取不同浓度(0.012 5～0.100 0 mg/mL)提取液加入ABTS+自由基工作液1 mL混合均匀，避光放置30 min后，于734 nm下测其吸光度值，以甲醇为空白对照，以不同浓度的抗坏血酸(0.012 5～0.200 0 mg/mL)作为阳性对照。重复测定3次。按式(2)计算ABTS自由基清除率。

1.2.6 铁还原能力测定 参考Benzie等[18]方法并略有改动。300 mmol/L pH 3.6醋酸钠缓冲液、10 mmol/L TPTZ、20 mmol/L FeCl3溶液，按照体积比10∶1∶1混合，混匀后于37 ℃水浴备用。吸取120 μL不同浓度(0.012 5～0.200 0 mg/mL)提取液，加入去离子水360 μL及FRAP溶液3.6 mL。混匀后于37 ℃水浴30 min，593 nm测定吸光值，重复测量3次，并以抗坏血酸代替提取物作为阳性对照。吸光度值越大，表明铁还原能力越强。

1.3 数据统计与分析

试验结果均表示为“平均值±标准偏差”，应用SPSS 11.5软件进行方差分析，并进行Duncan’s差异显著性分析，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 多酚得率、总酚含量和总黄酮含量

由表1可知，丙酮提取物的多酚得率最高，为(11.23±0.05) mg/100 g。不同溶剂提取物中总酚含量、总黄酮含量大小顺序为：丙酮提取物>乙醇提取物>甲醇提取物，且不同溶剂提取物中总酚含量、总黄酮含量存在显著差异。

表1 黑豆皮不同溶剂提取物的多酚得率、总酚含量和总黄酮含量†

† 同列字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2.2 DPPH自由基清除性能

由图1可知，丙酮提取物中DPPH自由基清除能力IC50最低[(0.059±0.005) mg/mL]，表明丙酮提取物的DPPH自由基清除能力最强，甲醇与乙醇提取物的DPPH自由基清除能力无显著差异，均低于抗坏血酸DPPH自由基清除能力[(0.021±0.004) mg/mL]。

图1 黑豆皮不同溶剂提取物的DPPH自由基清除性能

Figure 1 DPPH radical scavenging activities of black soybean seed coat with different solvents

2.3 ABTS自由基清除性能

由图2可知，丙酮提取物中ABTS自由基清除能力IC50最低[(0.057±0.004) mg/mL]，表明丙酮提取物的ABTS自由基清除能力最强，甲醇与乙醇提取物的ABTS自由基清除能力无显著差异，均低于抗坏血酸ABTS自由基清除能力[(0.017±0.002) mg/mL]。

图2 黑豆皮不同溶剂提取物的ABTS自由基清除性能

Figure 2 ABTS radical scavenging activity of solvent extracts prepared from black soybean seed coat

2.4 铁还原能力

由图3可知，所有提取液均表现出一定程度的铁还原能力，呈线性浓度依赖性，且提取物的铁还原能力显示出与DPPH和ABTS自由基清除活性相似的趋势。在相同的质量浓度时，铁还原能力大小顺序为：丙酮提取物>甲醇提取物>乙醇提取物。

图3 黑豆皮不同溶剂提取物的铁还原能力

Figure 3 Ferric reducing antioxidant power of different solvents from black soybean seed coat

3 结论

通过试验发现当体积分数均为70%时，丙酮提取物中多酚类物质含量(总酚、总黄酮)、抗氧化性均高于甲醇、乙醇提取物。黑豆皮富含多酚类物质，可应用于功能性食品或作为食品营养强化添加剂。试验仅对黑豆皮中多酚类物质总含量进行了测定，其功能性多酚单体的种类、含量及其多酚化合物代谢路径有待深入研究。