一种拟南芥基因高效编辑体系研究

欧阳乐军 马铭赛 陈梓洛 黄嘉玲 布梁灏 陈自银 李莉梅

(广东石油化工学院生物工程学院，茂名 525000)

近年来，随着越来越多物种全基因组测序的完成，人类已逐步迈进后基因组时代——功能基因组时代。后基因组时代面临的一个重大挑战是，如何从大量基因组数据库中获得特定基因的功能和相应的应用价值信息，而基因定点编辑技术恰恰是解决这一难题的有力工具[1]。2013年，基因定点编辑技术CRISPR/Cas9被研究人员报道，该基因编辑体系只需设计一个sgRNA就可对相关基因进行定点编辑，具有操作简单、成本低、效率高等特点，成为新一代最受欢迎的基因编辑技术[2]。相比传统的转基因技术，CRISPR/Cas9技术表达载体插入位点与基因编辑的位点不同，外源插入质粒待基因编辑完成后，可在后代配子形成过程中染色体分离时而被去除，编辑后不留下转基因的痕迹，无须引入外源基因，因而生物安全性高，无转基因争议，应用前景广阔[3～4]。但怎样快速筛选获得不含外源转化元件的基因编辑后代是一个关键技术问题[5]。

本研究创造性的将拟南芥种皮特异性启动子At2S3与荧光筛选标记基mCherry组装进植物基因组定点编辑的CRISPR载体pHDE中，以拟南芥as1为靶基因[6]，构建一种带有荧光筛选标记且可在转化后代中实现Cas9等外源转化元件有效分离剔除的基因安全、高效编辑体系，并在拟南芥进行验证研究，为建立一种更为生态安全、更高编辑效率的CRISPR/Cas9技术体系提供借鉴与参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

DH5α感受态细胞(鼎国MCC001)、GV3101农杆菌感受态细胞(鼎国)、pHDE基础载体(本实验室保存)、含mCherry与启动子的载体pHDE-mCherry质粒由加州大学圣地亚哥分校赵云德教授提供。高保真PFU酶、DNA Marker、限制性内切酶BsaⅠ购置NEB中国公司。本实验所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 表达载体的构建

1.2.1.1 靶位点的选择及引物序列

根据CRISPRscan找到目标基因as1的高评分靶点为目标序列。利用rgenome评估高评分靶点的脱靶情况，运用SnapGene软件进行载体构建分析，运用Primer Premier 5软件进行引物分析；运用DNAMAN软件进行序列分析(表1)。

表1 研究所用引物信息

1.2.1.2 重组质粒pHDE-At2S3-mCherry的构建

以含有所要扩增目的基因的质粒pHDE-mCherry为模板，分别扩增种皮特异性启动子(At2S3)和荧光筛选标记基因(mCherry)，以上述At2S3和mCherry的PCR产物为模板，用At2S3启动子的正向引物IDP-F和mCherry反向引物mCherry-R进行PCR扩增，电泳检验并切胶回收得到At2S3+mCherry的片段。将此片段与酶切后的pHDE质粒进行重组。热击法转化大肠杆菌、菌落PCR验证，将阳性质粒送样测序验证，具体载体构建方法参照欧阳乐军等[7]。载体构建各元件组成如图1所示。

图1 pHDE-At2S3+mCherry-as1重组质粒示意图Fig.1 Schematic representation of recombinant plasmid pHDE-At2S3+mCherry-as1

1.2.1.3 重组质粒pHDE-At2S3-mCherry-as1的构建

PCR扩增as1-gRNA，切胶回收后与酶切过的pHDE-At2S3-mCherry质粒进行重组。热击法转化大肠杆菌，并进行菌落PCR验证，对阳性重组质粒测序验证。

1.2.2 工程菌的制备及拟南芥转化

采用冻融法，将测序正确的重组质粒pHDE-At2S3-mCherry-as1转进农杆菌，并进行菌落PCR验证，制备工程菌液。经花序浸染法浸泡拟南芥的花苞，收集转化后的种子，通过580 nm波长下的荧光显微镜筛选带有红色荧光的种子，种植培育获得T1代转化植株。

1.2.3as1基因编辑效率鉴定

在目标基因as1的两个靶序列上下游设计鉴定引物as1-GT1与as1-GT2，对挑选出的T1代红色荧光种子培育的植株用PCR仪(ABI Veriti 96)进行PCR及测序鉴定，PCR引物见表1，PCR反应条件(PrimeSTAR Max DNA Polymerase)为94℃预变性4 min，40个循环(94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 450 s)，最后72℃延伸2 min。因两个target的靶序列设计将使目标基因as1模板从中间大片段敲除，纯合突变只能扩增得到一个小片段，杂合突变将得到大小两个片段，而野生型只能扩增出一个大片段。

1.2.4 Cas9外源转化元件的分离鉴定

以表达载体上的Cas9序列设计Cas9鉴定引物(表1)，以T1代带红色荧光种子与T2无荧光种子后代植株基因组为模板，扩增Cas9序列，扩增反应程序同1.2.3，扩增结束后进行电泳鉴定。

2 结果与分析

2.1 表达载体的构建结果及分析

2.1.1 重组质粒pHDE-At2S3-mCherry的构建

限制性内切酶BsaⅠ酶切后载体pHDE与At2S3-mCherry进行连接,连接产物转化DH5α后菌落PCR鉴定,阳性克隆扩增出800 bp左右的特异性片段，大小与At2S3-mCherry片段大小相符。提取鉴定结果为阳性的菌液质粒，测序结果正确，证明重组载体pHDE-At2S3-mCherry构建成功。PCR及测序鉴定结果如图2所示。

图2 重组质粒pHDE-At2S3-mCherry构建PCR A.At2S3的PCR扩增；B.筛选标记基因mCherry的PCR扩增；C.At2S3+mCherry的片段PCR扩增；D.阳性菌落PCR验证Fig.2 PCR amplification of pHDE-At2S3-mCherry A.PCR amplification of the 35S promoter; B.PCR amplification of mCherry; C.PCR amplification of At2S3+mCherry fragment; D.PCR verification of Positive colony

图3 目的片段as1-gRNA片段的PCR扩增 1.DNA标准品；2.为扩增后的目的片段Fig.3 PCR amplification of the as1-gRNA 1.DNA standard; 2.PCR amplification of target fragments

图4 重组质粒PCR验证 1.DNA标准品；2～3.重组质粒PCR；4.阴性对照；5.阳性对照Fig.4 PCR verification of recombinant plasmid 1.DNA standard; 2～3.PCR amplification of recombinant plasmid; 4.Negative control; 5.Positive control

2.1.2 重组质粒pHDE-At2S3+mCherry-as1的构建

将线性化的载体与PCR扩增得到的as1片段组装，重组质粒经热击法转化大肠杆菌感受态细胞，质粒PCR鉴定后，选择阳性质粒送样测序(图3～4)。测序结果显示as1片段成功插入，pHDE-At2S3+mCherry-as1载体构建成功。

2.2 拟南芥转化及突变体鉴定结果

采用花序浸染法浸泡拟南芥的花苞，农杆菌转化成功后的T1代种子在荧光显微镜下具有红色荧光(图5:A)，挑选有荧光的种子培育得到T1代植株，Cas9 PCR鉴定结果为阳性(图8)。随机提取部分植株基因组进行as1的PCR检测，17颗T1代植株中共有7株转化后代可以扩增出一条小带的纯合突变，纯合突变的比率达到41%(图6)，与野生型相比，突变性状明显(图5:C,D)，与已知的as1突变体性状相同。将扩增得到的纯合突变小带回收送样至上海生工广州测序部测序，结果与实验设计预期的编辑效果完全一致，在两个target间成功编辑了405 bp大小的碱基(图7)。图中标记位置为前后两个target的PAM位置前3个碱基处，在此中间的405 bp碱基序列被成功敲除。

2.3 外源转化元件在纯合突变体中的分离鉴定

从纯合突变的的T1代种子中筛选出不带荧光的种子，培育得到T2代植株，提取基因组对外源Cas9等转化元件进行PCR鉴定，结果扩增不到Cas9序列，说明不带荧光的种子后代已不含有外源Cas9转化元件(图9)，

图5 拟南芥突变体与野生型的表型比较 A.荧光种子和野生型种子;B.拟南芥野生型幼苗；C～D.突变纯合体幼苗Fig.5 The Phenotypic comparison of Arabidopsis mutants and wild type A.Fluorescent seeds and Wild seeds; B.The Arabidopsis wild-type seedling; C-D.Themutant homozygotes seedling

图6 T1代植株中纯合突变PCR鉴定 M.DNA标准品； 1～17.T1代植株，纯合突变：3～5、7、9、12、13；杂合突变：1、2、8、10-11、16；18.野生型对照Fig.6 PCR identification of mutant in T1 plants M.DNA standard；1-17.Homozygous mutation of T1 generation plants; 3-5、7、9、12、13；Heterozygous mutation of T1 generation plants; 1,2,8,10-11,16；18.Wild-type

图7 纯合突变测序结果图Fig.7 The sequencing result of homozygous mutation

图8 T1代植株中Cas9基因PCR鉴定图 M.DNA标准品；1～2.阳性与阴性对照；3～8.T1代纯合编辑植株Fig.8 PCR identification of Cas9 in T1 plants M.DNA standard；1-2.Positive and negative control; 3-8.Homozygous mutation of T1 generation plants

图9 T2代植株Cas9基因PCR鉴定图 M.DNA标准品；1.野生型；2～16.T2代纯合编辑植株Fig.9 Identification of target genes knockout in T2 plants M.DNA standard; 1.Wild-typecontrol; 2-16.Homozygous mutation of T2 generation plants

3 讨论

CRISPR/Cas9技术与传统植物转基因技术相比，具有更明显的实际应用价值与优势。一是传统的转基因技术具有插入位点的随机性与不确定性，易产生其他内源基因破坏、外源基因沉默等现象，使基因的精确修饰与改造效率低下；其次是CRISPR/Cas9技术体系在完成对靶标基因的遗传编辑之后通过后代配子形成过程中染色体的分离而去除，在编辑后代中不留下转基因的痕迹，无须引用外源基因，生物安全性高，特别是随着CRISPR/Cas9技术的进一步成熟，其所具有的优势得到进一步显现。应用范围也将越来越广泛，对于任何物种的基因组定点编辑都将成为可能[8～10]。

本研究通过设计两对sgRNA，使其同时识别基因靶序列，提高靶标识别特异性，在T1代中获得纯合突变子的概率高达40%以上。同时，通过将种皮特异性启动子At2S3和mCherry荧光蛋白偶联在载体中，在荧光显微镜特定波长的照射下，利用荧光蛋白所发出的特殊荧光，实现对突变体的可视化筛选，提高筛选效率。最后特异性的利用CRISPR/Cas9技术体系在完成对靶标基因的遗传编辑之后通过后代配子形成过程中染色体的分离而去除，在编辑后代中不留下转基因的痕迹，无须引用外源基因，生物安全性高的特点，应用外源转化元件中带有荧光蛋白的标记特性，先筛选带有荧光的种子，提高获得转化后代阳性植株比例，随后从纯合突变中挑选不带荧光的转化后代，将外源转化元件实现成功分离，获得不带有Cas9等转化元件的基因编辑后代，这种通过可视化荧光筛选标记来快速判断种子中是否含有CRISPR/Cas9表达系统的方法简单易行，准确率高，对基因编辑事件的初步检测只需要进行简单的PCR分析即可，极大的提高了工作效率。本研究构建的一种带有可视化筛选标记的大片段基因编辑方法，为有性繁殖作物基因编辑后代中获得无外源转化元件的新种质资源提供了一种全新的技术参考，具有一定的创新性[11～12]。

CRISPR/Cas9系统作为一种有效的基因编辑工具，具有操作简单，高效性和特异性等其他基因编辑工具所不具备的优势[13～16]。研究人员可以有效的针对不同基因进行编辑，深入研究基因功能，还可一次编辑多个基因，对于多基因控制的信号通路中互作机制等基础科学问题研究以及多基因调控的农林作物重要经济、农艺性状遗传改良具有十分明显的应用价值[17～18]。想要更好的实现对CRISPR/Cas9的应用，研究人员还面临如何减少脱靶现象的发生以及进一步提高基因编辑效率？随着CRISPR/Cas9的广泛应用与深入开展，科技工作者一定可以更好的利用CRISPR/Cas9技术为人类的生产生活服务[19～20]。