MALDI-TOF MS用于耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌同源性分析的研究*

徐建民，蒋 虔，杨 哲，李好莲，姜 铮，宋世平，袁顺宗，尹秀云，陈建魁

(解放军总医院第五医学中心/原解放军第307医院检验科，北京 100071)

越来越多碳青霉烯类抗菌药物耐药菌株的出现使临床针对感染治疗的形势愈发严峻[1]。碳青霉烯类抗菌药物耐药机制与细菌的生物被膜形成，外膜孔蛋白丢失合并β内酰胺酶的过度表达，或菌株表达碳青霉烯酶相关[2-6]。产碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的重要机制[7]。该酶的编码基因主要位于转座子、整合子、质粒等可移动的基因单元上，从而导致耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)可以通过垂直或水平方式快速出现及传播[6]。临床上治疗CRKP感染的手段极其有限，一般只能采取患者隔离或对住院环境采取消毒等措施[8]。因此，快速准确的对CRKP进行同源性分析，及时有效的溯源对控制院内感染尤为重要。

多位点序列分型(MLST)是通过聚合酶链式反应(PCR)扩增管家基因片段并进行序列分型，根据其序列型(ST)结果进行同源性分析。可通过网络实现室间数据共享及比对，数据分析简便快捷、可比性强、能直接对临床标本进行分析[9]。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术用于微生物快速鉴定是近年来的研究热点，它是利用MALDI-Biotyper 3软件构建发育树对其进行同源性分析，具有快速、准确、重复性好的特点，在国内临床微生物实验室已得到较好地应用[10]。

笔者以MLST分型方法获得的同源性结果为标准[11]，对MALDI-TOF MS获得的同源性分析结果进行评价，探索MALDI-TOF MS对耐药肺炎克雷伯菌同源性分析在临床实验室应用的准确性和可行性。

1 材料与方法

1.1CRKP菌株 菌株的来源分布、MLST分型引物序列、扩增条件及扩增产物结果处理方法，参照笔者前文[9]。

1.2方法 将95株CRKP接种于哥伦比亚血平皿上，放入温度为35 ℃、CO2浓度为5%的培养箱中培养24 h。用灭菌竹签挑取单个菌落，少量菌体均匀涂布在靶板孔位上，室温下晾干。加1 μL 70%甲酸溶液均匀涂覆在样本上，室温下晾干。再加1 μL IVD HCCA基质溶液均匀覆盖在待测样本上，室温下晾干。将加样完成的待测靶板放入MicroflexTM质谱仪，进行上机检测。利用MicroflexTM质谱仪配套软件MALDI Biotyper RTC进行蛋白质指纹峰图谱的采集。结果评价分数判断标准：2.0分以下为匹配一般，2.0～<2.3分为匹配较好，2.3～3.0分为匹配好；并将蛋白质指纹峰谱图导入MALDI-Biotyper 3软件进行聚类分析。

2 结 果

2.1指纹图谱获得 95株CRKP鉴定得分均超过2.3，结果为匹配好，表明获得的蛋白指纹图谱较完整，可以进行聚类分析，见表1。

表1 95株CRKP MALDI-TOF MS鉴定得分详表

2.2质谱聚类分析结果 首先通过MicroflexTM质谱仪的分析软件Flexanalysis获得蛋白质指纹峰信息，再将蛋白质指纹峰谱图导入MALDI-Biotyper 3软件进行聚类分析。从聚类分析图中可发现：95株菌可分为Ⅰ、Ⅱ 2个大类，Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc、Ⅱa、Ⅱb 五个亚类，95株CRKP聚类分析树状图中，可以直观的发现Ⅰ类中Ⅰb和Ⅰc亚类亲缘关系较近，Ⅰa亚类与Ⅰb、Ⅰc亚类亲缘关系较远；Ⅱ类中Ⅱa和Ⅱb亚类亲缘关系较近。见图1。

图1 95株CRKP蛋白峰聚类分析图

表2 MLST、MALDI-TOF MS结果与来源科室分布

注：其余为Q1、Q3、Q6～8、Q12～17、Q19～20、Z1～23、Z25～31、N1～30、I1～17

2.3质谱聚类分析与MLST分型结果的比较 笔者之前的研究中[9]，MLST分型结果显示：Q2号菌株为ST1型，Z24号菌株序列为ST15型，Q4为ST1198型，Q5为ST152型，Q9为ST1030型，Q10为ST2260型，Q11为ST1254型，Q18为ST2928型，另外87株CRKP的MLST分型均为ST11型。利用在线分析软件eBURST V3对上述MLST结果进行分析，结果最终显示ST2260和ST11为同一克隆型，ST1、ST15、ST152、ST1030、ST1198、ST1254、ST2928为单个型。证明其中88株菌株亲缘关系近，另外7株菌亲缘关系较远。本研究中，MALDI-TOF MS聚类分析结果却将95株CRKP分为了2大类，5个亚类。与MLST结果相比较后，发现87株ST11型分布在各亚类中，Q4、Q5、Q9、Q11分布在Ⅱa；亚类中Q10、Q18分布在Ⅱb亚类中；Q2、Z24分布在Ⅰb亚类中。见表2。

3 讨 论

MALDI-TOF MS 鉴定基于细菌表达的蛋白质峰的特征及丰度，通过分析待测菌体蛋白质峰图与模式菌蛋白质峰图之间的相似处，进而得到鉴定结果[12]。蛋白质由遗传基因物质决定，相对分子质量较大，性质相对稳定，MALDI-TOF MS通过分析同菌种间的细微差异，可以对细菌进行进一步分型[13]。其实验特点是简单、快速，可在几分钟内通过MALDI-Biotyper 3获得聚类分析及主成分图。近来有国内学者研究证明[14-17]，MALDI-TOF MS聚类分析可以对常见致病菌及耐药菌进行同源性分析。

国内学者谢思[18]对53株CRKP进行MLST和MALDI-TOF MS同源性分析发现，两种方法结果相近，学者认为MALDI-TOF MS的结果比MLST结果能更详细的展示各菌株之间的亲缘关系。MENCACCI等[19]采用MALDI-TOF MS对35株泛耐药鲍曼不动杆菌进行同源性分析，结果与重复序列PCR的分型结果基本相符，学者认为在未获得基因分型结果前，MALDI-TOF MS 可以用来对耐药菌暴发感染的提前判断。

笔者之前的研究中[11]，MLST分型结果显示：Q10为ST2260型，Q2号菌株为ST1型，Z24号菌株序列为ST15型，Q5为ST152型，Q4为ST1198型，Q9为ST1030型，Q11为ST1254型，Q18为ST2928型，其余87株CRKP的MLST分型均为ST11型。eBURST V3对以上MLST结果进行进一步分析，最终结果显示ST2260和ST11为同一克隆型，ST1、ST15、ST152、ST1030、ST1198、ST1254、ST2928，7株为单个型。结果显示1株ST2260和87株ST11，共88株菌株亲缘关系近，另外7株菌亲缘关系较远。而MALDI-TOF MS聚类分析结果却将95株CRKP分为了两大类，5个亚类，两种方法结果相比较发现，Q2、Z24分布在Ⅰb组中；Q4、Q5、Q9、Q11分布在Ⅱa组中；Q10、Q18分布在Ⅱb组中，其余87株ST11型各亚类中均有分布。

研究结果显示，MicroflexTM质谱仪聚类分析结果与MLST分型结果并不完全一致，原因分析：MLST的分型原理是从基因分子层面对细菌进行分析，虽然该方法检测了7对管家基因，但对于分析含有大量基因组序列插入或缺少某些基因组序列详细信息的菌株存在一定的局限性；MALDI-TOF MS聚类分析原理基于蛋白质的表达及其表达丰度，然而临床分离自CRKP受到抗菌药物选择压力、感染位置、分离培养环境等因素的影响，其某些菌体蛋白可能过表达或不表达。使其蛋白峰图产生差别，从而导致进一步聚类分析时产生误差。与国内外部分学者的研究结果相比较，笔者实验结果与前者部分研究结果并不完全相符。可能与研究中的标本量比前者的实验标本数量更多，来源科室更多有关系。如此一来，MALDI-TOF在CRKP同源性分析方面的应用还需要更深入的研究。SACHSE等[20]研究对比了MALDI-TOF、MLST及随机引物扩增DNA多态性分析三种同源性分析方法，结果显示，三种方法之间结果并不完全一致。该学者认为，MALDI-TOF MS应用于临床需要更多、更进一步的研究证实。

4 结 论

从本实验结果上看，虽然MALDI-TOF MS聚类分析能够将95株CRKP亲缘关系显示的比较直观清晰，但是该方法广泛应用于临床菌株同源性分析还需要更深入的实验研究。