银杏叶多糖的吸湿保湿性能及体外透皮吸收特性研究

何杜朋， 陈锦桃， 崔旭兰， 袁劲松

（1.南方医科大学深圳医院，广东深圳518000；2.北京大学深圳医院，广东深圳518000）

银杏叶为银杏科植物银杏（Ginkgo biloba L.）的干燥叶，含有多种成分，如黄酮类、内酯类、多糖类、酚类等，具有免疫调节、抗衰老、抗氧化、抗炎、抗肿瘤、降血脂等生物活性[1，2]。近年来关于银杏叶多糖的抗氧化活性研究表明，其对DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子等具有较强清除作用[3，4]，又基于多糖类物质具有较好的吸湿、保湿及营养肌肤等作用研究[5]，提示银杏叶多糖在现代保健、护肤等产品开发方面具有一定的潜在价值。而有关银杏叶多糖的保湿吸湿性能及透皮吸收性能的评价尚无研究报道。另有研究报道，丙三醇、海藻酸钠具有良好的保湿吸湿功能，已广泛应用于美容护肤产品[6]。因此，本研究以其为对照，采用水提醇沉、Seveage法除蛋白、纤维素柱层析等方法制备银杏叶多糖，测定其在不同相对湿度环境下的吸湿率、保湿率，同时通过离体透皮实验，分析评价其经皮渗透能力，为其作为天然抗氧化剂的开发应用提供依据，现将研究结果报道如下。

1 材料

1.1 仪器UV-1700双光束紫外分光光度计[岛津企业管理（中国）有限公司]；YB-P6智能透皮试验仪（天津药典标准仪器厂）；DL-720E超声仪（上海之信仪器有限公司）；SC-3610低速离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司）；S30-UV实验室纯水系统（上海和泰仪器有限公司）；CP-225D电子天平（0.01mg）（德国赛多利斯公司）；ME-204电子天平（0.000 1 g）（瑞士梅特勒—托利多公司）；DZF-6050真空干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）。

1.2 试药 银杏叶（批号：鲁1702001），由江西樟树天齐堂中药饮片有限公司提供，经北京大学深圳医院袁劲松主任中药师鉴定，所用药材符合《中华人民共和国药典》2015版要求。D-无水葡萄糖对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110833-201506）。其余试剂均为市售分析纯。

1.3 动物SPF级健康SD大鼠，体质量（200±10）g，由广东省医学实验动物中心提供，动物质量合格证号：SYXK（粤）2017-0125。

2 方法与结果

2.1 银杏叶多糖的制备[7]称取银杏叶干品100 g，先用石油醚提取至提取液无色，药渣风干后加入水加热回流提取3次，1.5 h/次，过滤，滤液浓缩至适量，加入氯仿和正丁醇溶液混合液（V∶V=5∶1），振荡，反复多次除去变性蛋白质。在已脱蛋白溶液中加入体积分数95%乙醇调至终浓度为80%，4℃静置24 h，抽滤，沉淀物依次用体积分数95%乙醇、无水乙醇洗涤2～3次，真空干燥至恒质量，得到粗多糖8.36 g。再将粗多糖通过纤维素柱，蒸馏水洗脱，Molish反应检测至洗脱液呈阴性。合并洗脱液，浓缩至适量，用乙醇沉淀，4℃静置24 h，抽滤，沉淀物依次用无水乙醇洗、丙酮洗涤2～3次，真空干燥，得到多糖4.28 g（多糖含量为2.94 g）。

2.2 吸湿性能研究[8，9]于室温（25±1）℃，将饱和醋酸钾溶液、饱和碳酸钾溶液和饱和硫酸铵溶液分别放入干燥器内，控制相对湿度（RH）为43%、60%、81%。准确称取3份银杏叶多糖、丙三醇、海藻酸钠，1.0 g/份，加入到直径3 cm的称量瓶中，再分别放置于以上干燥器内，于1、2、4、8、12、16、24 h等不同时间点，测定样品放置前、后的质量（m0、mn），计算吸湿率：吸湿率（%）=100（mn-m0）/m0。同时，以吸湿率为纵坐标、时间为横坐标，绘制变化曲线，计算其趋势线斜率k，即为样品的吸湿速率。

RH43%的环境中，各样品在0～24 h内的吸湿率高低依次为丙三醇＞海藻酸钠＞银杏叶多糖，在24 h的吸湿率分别为81.2%、32.8%、27.5%。其中，丙三醇的吸湿率上升速度最快（k=9.434），而海藻酸钠（k=3.088）与银杏叶多糖（k=2.634）则是缓慢上升，且较为接近。吸湿率变化见图1，趋势线见表1。

图1 RH43%时不同样品的吸湿率变化情况（n=3）Figure 1 Comparison of themoisture-absorption rate of the differentsam p les atRH43%（n=3）

表1 RH43%时不同样品的吸湿率变化趋势线Tabel1 Trend line of themoisture-absorption rate of the differentsam p les atRH43%

RH60%的环境中，各样品在0～24 h内的吸湿率高低依次为丙三醇＞海藻酸钠≈银杏叶多糖，在24 h的吸湿率分别为93.2%、35.7%、36.9%。其中，丙三醇的吸湿率上升速度依然最快（k=10.570），而海藻酸钠（k=3.292）与银杏叶多糖（k=2.788）则是缓慢上升，且较为接近。与RH42%环境相比，各样品吸湿率均有所增加。吸湿率变化见图2，趋势线见表2。

图2 RH60%时不同样品的吸湿率变化情况（n=3）Figure 2 Com parison of themoisture-absorption rate of the differentsam ples atRH60%（n=3）

表2 RH60%时不同样品的吸湿率变化趋势线Table 2 Trend line of themoisture-absorption rate of the differentsam p les atRH60%

RH81%的环境中，各样品在0～24 h内的吸湿率高低依次为丙三醇＞银杏叶多糖＞海藻酸钠，在24 h的吸湿率分别为114.5%、47.2%、42.5%。其中，丙三醇的吸湿率上升速度仍是最快（k=13.270），而银杏叶多糖（k=3.992）与海藻酸钠（k=3.400）则表现为缓慢上升，且较为接近。与RH42%、RH60%环境相比，各样品吸湿率均明显增加，表明随着环境相对湿度的增加，其吸湿效率也随之提高。吸湿率变化见图3，趋势线见表3。

图3 RH81%时不同样品的吸湿率变化情况（n=3）Figure 3 Comparison of themoisture-absorption rate of the differentsam ples atRH81%（n=3）

表3 RH81%时不同样品的吸湿率变化趋势线Table 3 Trend line of themoisture-absorption rate of the differentsam p les atRH81%

2.3 保湿性能研究[8，9]各平行称取3份银杏叶多糖、丙三醇、海藻酸钠，5 g/份，加入2 g超纯水，混匀后称取2 g于直径3 cm的称量瓶中，于室温（25±1）℃置于装有干硅胶的干燥器内。于1、2、4、8、12、16、24 h等不同时间点，测定样品放置前、后的水分质量（m0、mn），计算保湿率：保湿率（%）=100mn/m0。同时，以保湿率为纵坐标、时间为横坐标，绘制变化曲线，计算其趋势线斜率k，即为样品的保湿速率。

干硅胶环境中，在0～24 h的保湿率高低依次为银杏叶多糖＞海藻酸钠＞丙三醇，在24 h的保湿率分别为63.6%、59.6%、42.5%，其中，丙三醇的下降速率最快（k=-6.676），海藻酸钠次之（k=-5.221），银杏叶多糖最慢（k=-4.359）。保湿率变化见图4，趋势线见表4。

2.4 多糖含量测定[10，11]

2.4.1 溶液制备 对照品溶液：称取D-无水葡萄糖对照品10.17mg于100mL容量瓶中，加入超纯水溶解、定容，配制成质量浓度为0.101 7mg/mL的对照品溶液。供试品溶液：称取银杏叶多糖15.22mg于100mL容量瓶中，加入生理盐水超声溶解、定容，配制成质量浓度为0.152 2mg/mL的供试品溶液。

图4 干硅胶环境中不同样品的保湿率变化情况Figure 4 Com parison of themoisture-retention rate of the differentsam ples under dry silica gelcondition

表4 干硅胶环境中不同样品的保湿率变化趋势线Table 4 Trend line of themoisture-absorption rate of the differentsamp les under dry silica gelcondition

2.4.2 线性范围考察 精确吸取D-无水葡萄糖对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL，分别加水至1.0mL，再加入5%苯酚溶液1.0mL、浓硫酸5.0 mL，沸水浴反应15min；取出冷却至室温，平行操作3份。另取超纯水1.0mL，加入同量的5%苯酚、浓硫酸，作为空白对照。于紫外分光光度计中490 nm波长处测定吸光度值。以吸光度值为纵坐标、D-无水葡萄糖质量浓度为横坐标，得回归方程Y=0.090 9X+0.032 1（R2=0.998 5），表明D-无水葡萄糖对照品在1.451～7.257μg/mL范围内呈现良好的线性关系。

2.4.3 精密度考察 精确吸取D-无水葡萄糖对照品溶液0.3mL，平行3份，同法显色反应后连续测定6次，计算得平均吸光度值为0.421，相对标准偏差（RSD，sR）=0.49%，表明仪器精密度良好。

2.4.4 重复性考察 精确吸取供试品溶液0.3mL，平行6份，同法显色反应后测定吸光度值，计算得平均吸光度值为0.438，sR=0.92%，表明方法的重复性良好。

2.4.5 稳定性考察 精确吸取供试品溶液0.3mL，平行3份，同法显色反应后每隔1 h测定吸光度值，连续6 h，计算得平均吸光度值为0.440，sR=0.62%，表明方法的稳定性良好。

2.4.6 加样回收率 精确吸取已知含量的供试品溶液0.3mL，平行6份，分别加入质量浓度0.101 7 mg/mL的D-无水葡萄糖对照品溶液0.3mL，同法显色反应后测定吸光度值，计算得平均回收率为98.63%，sR=0.92%，表明方法的准确性良好。

2.5 体外透皮吸收实验[12，13]将雄性大鼠处死，腹部脱毛后取其皮肤，去除脂肪等，生理盐水冲洗干净，剪成2.0 cm×2.0 cm大小。取大鼠皮肤角质层向上，固定于Franz扩散池的供给室与接受室之间，再往接受室中加入生理盐水，排尽气泡。准确称取浓度为5%、10%的银杏叶多糖溶液1.0 g于供给室，铺满离体大鼠皮肤，敞口密封。设置水浴温度（37±1）℃、转速200 r/min，计时开始后于1、2、4、6、8、10、12、18、24 h等不同时间进行取样1.0mL，同时补加等量同温的接受液。样品溶液采用苯酚—硫酸法进行显色反应，应用紫外—可见分光光度计测定多糖含量，计算单位面积的累积渗透量（Q）：。

其中Cm为第m个取样点测得的药物浓度（μg·mL-1），V为接受液体积（17mL），Ci为第i个取样点测得的药物浓度（μg·mL-1），Vi为取样体积，A表示释药面积（cm2）。

同时，以时间t为横坐标、药物累积渗透量Q为纵坐标，绘制累积渗透曲线，同时进行线性回归，所得Q-t直线方程的斜率即为稳态透皮速率JSS，通过方程的截距可算得滞后时间Tlag，渗透系数K p=JSS/C（0C0为扩散池中的药物初始质量浓度）。

由结果可知，在0～24 h内，1%、5%、10%浓度的银杏叶多糖均较为匀速地缓慢渗透，其中，稳态透皮速率JSS、时滞Tlag均逐渐上升，而渗透系数K p及累积透过率则逐渐下降。三者相比，银杏叶多糖溶液的渗透速率、时滞均随浓度的提高而升高，但是渗透系数与累积渗透率却随着逐渐下降。见图5、表5。

2.6 体外透皮吸收规律研究[14]以不同时间点的累积渗透量拟合零级动力学、一级动力学、Higuchi、Weibull、Hixson-Crowell、Ritger-Peppas等药物释放数学模型，比较r2值可知，1%、5%、10%的银杏叶多糖均以Ritger-Peppas为最佳拟合模型（r2分别0.979 1、0.988 2、0.983 5），表明其体外透皮吸收规律符合Ritger-Peppas模型。具体结果见表6。

图5 不同浓度银杏叶多糖溶液在不同时间点的累积渗透量变化Figure 5 Changes of the cumulative permeability of Ginkgo biloba leaves polysaccharide solution w ith different concentrations atdifferent time points

3 讨论

我国的银杏叶产量占据世界的90%以上，资源十分丰富，且银杏的叶、果和外种皮等部位均含有多糖。本研究立足于银杏叶多糖的保湿吸湿、透皮吸收性能的评价，可为其在美容护肤方面的应用提供依据，不仅可以更为显著地提高银杏叶的资源利用率，而且还能创造更高的经济价值，更大地调动种植户的积极性，具有重要的意义。

由于皮肤直接与空气接触，空气中的湿度对于多糖能否发挥明显的保湿吸湿效果起到关键性的影响。本研究体外模拟高湿、低湿以及干燥环境，考察银杏叶多糖在不同相对湿度环境下的保湿吸湿性能变化。结果发现：银杏叶多糖随着相对湿度（43%、60%、81%）的上升，吸湿率逐渐上升，显示吸湿性能亦有所提高；与丙三醇、海藻酸钠相比，银杏叶多糖吸湿性能均弱于丙三醇，但与海藻酸钠相近（中低湿度环境）甚至更优（高湿度环境）；在干燥环境下，银杏叶多糖的保湿性能则优于其他二者。表明银杏叶多糖的保湿吸湿性能较为均衡，可在不同环境中发挥不同作用，是一种性价比高、综合性强的保湿剂。分析认为，丙三醇为小分子，含有多个-OH，因此在吸湿方面表现出更强的能力；而银杏叶多糖（-OH等）与海藻酸钠（-COONa、-OH等）均属于多糖类物质，分子量均较大，表现出相似的性能。

表5 不同浓度银杏叶多糖的体外渗透动力学参数Table 5 Com parison of the parameters of penetration kinetics of the differentconcentrations of Ginkgo biloba leaves polysaccharose

表6 不同浓度银杏叶多糖的药物释放数学模型拟合Table 6 Mathematicalmodel fitting for drug release of Ginkgo Biloba leaves polysaccharide w ith differentconcentrations

在体外经皮吸收中发现，1%、5%、10%浓度的银杏叶多糖溶液的渗透系数分别为28.89×10-5、7.56×10-5、4.11×10-5cm·h-1，表明不同浓度的银杏叶多糖均能缓慢地经皮渗透。其中在各时间点的单位面积渗透量、稳态渗透速率、时滞方面，随着浓度的升高，渗透量增加、速率升高、时间滞留量更多，表现出正相关关系；而对于渗透系数与累积渗透率而言，则是随着浓度的升高而降低，呈现负相关关系。通过对不同时间的累积渗透量进行药物释放数学模型拟合发现，3个不同浓度的银杏叶均以Ritger-Peppas模型的拟合度为最高，提示银杏叶多糖在皮肤与接受液所构成的骨架体系中进行溶蚀扩散与释放。另外，银杏叶多糖除了对皮肤具有保湿吸湿功能外，还能够渗透入皮肤，发挥其他作用。