补髓生血颗粒对慢性再生障碍性贫血患者骨髓VLA-4和VLA-5mRNA表达的影响

王金环， 李鹤然， 郝晶， 栾仲秋， 孙凤， 赵伟，王小东， 田飞， 孙岸弢， 孙伟正

（1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江哈尔滨150040；2.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040；3.中国中医科学院广安门医院，北京100700）

慢性再生障碍性贫血（chronic aplastic anemia，CAA），属于原发性骨髓造血衰竭性贫血的一种，其主要表现是红髓衰竭和骨髓小粒空虚，以贫血、出血、感染为主要临床表现[1]。中医将其称为“髓劳病”，病位在骨髓。其病机为“肾虚髓枯为本，脾虚气血不足为标”，治疗则以补益为原则，以补肾填精为基本大法。我们在前期研究的基础上，进一步探讨补肾生血中药治疗CAA的疗效机理和作用机制，观察补髓生血颗粒对CAA患者骨髓极迟活化抗原4（very late antigen-4，VLA-4）和极迟活化抗原5（very lateantigen-5，VLA-5）mRNA表达的影响，现将研究结果报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2015年11月至2016年10月期间黑龙江中医药大学附属第一医院血液病科门诊及住院部所收集的30例CAA肾阴阳两虚型患者为试验组，其中男18例，女12例。另招募10例无血液疾病及免疫系统疾病的健康志愿者为正常对照组。

1.2 诊断标准 参照张之南主编的第3版《血液病诊断及疗效标准》[2]中CAA的诊断标准和《中药新药临床研究指导原则》[3]中慢性髓劳病的中医证候诊断标准，中医证型为肾阴阳两虚型。

1.3 纳入标准 ①符合CAA的西医诊断标准和慢性髓劳病的中医证候诊断标准，中医证型为肾阴阳两虚型；②发病后未经西医治疗或经过治疗6个月以上无效者；③年龄大于22岁且小于56岁；④同意参加本研究，签署知情同意书，并有良好依从性的患者。

1.4 排除标准 ①妊娠期及哺乳期妇女；②患有引起全血细胞减少的其他疾病患者；③对试验药物成分过敏的患者；④精神性疾病患者；⑤合并有严重心、脑、肝、肾疾病患者；⑥依从性差，未按规定服药，疗程不足6个月的患者。

1.5 治疗方法 试验组患者给予补髓生血颗粒治疗。用法：入选患者均于入组前2周停服其他治疗CAA的药物，2周后开始服用补髓生血颗粒（为黑龙江中医药大学附属第一医院院内制剂，主要由人参、熟地黄、鹿茸、白花蛇舌草、山茱萸、巴戟天、猪苓、淫羊藿等药物组成），每日3次，每次1袋，连续服用6个月。

1.6 观察指标及测定方法 应用实时荧光定量逆转录—聚合酶链反应（PT-PCR）法检测CAA患者治疗前后骨髓VLA-4和VLA-5mRNA表达水平的变化情况。

1.7 统计方法 采用SPSS 22.0统计软件进行数据的统计分析处理。计量资料数据采用均数±标准差（）表示，组间比较采用两独立样本t检验，组内治疗前后比较釆用配对样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 试验组患者治疗前后骨髓VLA-4mRNA表达水平比较 表1和图1结果显示：治疗前，试验组患者骨髓VLA-4mRNA表达水平明显低于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗后，试验组患者VLA-4mRNA表达水平较治疗前有一定程度升高，差异有统计学意义（P＜0.05），但仍未恢复到正常对照组水平，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 试验组患者治疗前后骨髓VLA-4m RNA表达水平比较Table 1 Com parison of VLA-4m RNA expression level in the bonemarrow of the trialgroup before and after treatment（）

表1 试验组患者治疗前后骨髓VLA-4m RNA表达水平比较Table 1 Com parison of VLA-4m RNA expression level in the bonemarrow of the trialgroup before and after treatment（）

①P＜0.05，与正常对照组比较；②P＜0.05，与治疗前比较

组别N VLA-4mRNA治疗前 治疗后试验组正常对照组30 10 23.61±1.73①45.39±1.27 38.29±2.01①②

图1 试验组患者治疗前后骨髓VLA-4m RNA表达水平与正常对照组比较Figure 1 Comparison of VLA-4mRNA expression level in the bonemarrow of the trialgroup before and after treatmentw ith normalcontrolgroup

2.2 试验组患者治疗前后骨髓VLA-5mRNA表达水平比较 表2和图2结果显示：治疗前，试验组患者VLA-5 mRNA表达水平明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗后，试验组患者VLA-5mRNA表达水平较治疗前有一定程度下降，差异有统计学意义（P＜0.05），但仍未恢复到正常对照组水平，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 试验组患者治疗前后骨髓VLA-5m RNA表达水平比较Table 2 Comparison of VLA-5mRNA expression level in the bonemarrow of the trialgroup before and after treatment（）

表2 试验组患者治疗前后骨髓VLA-5m RNA表达水平比较Table 2 Comparison of VLA-5mRNA expression level in the bonemarrow of the trialgroup before and after treatment（）

①P＜0.05，与正常对照组比较；②P＜0.05，与治疗前比较

组别N VLA-5mRNA治疗前 治疗后试验组正常对照组30 10 24.85±3.24①8.02±3.20 16.32±3.19①②

图2 试验组患者治疗前后骨髓VLA-5m RNA表达水平与正常对照组比较Figure 2 Com parison of VLA-5m RNA expression level in the bonemarrow of the trialgroup before and after treatmentw ith normalcontrolgroup

3 讨论

补髓生血颗粒历经50多年的临床研究与实践，疗效确切。笔者在过去的临床实践中，通过观察205例慢性再生障碍性贫血（CAA）患者，发现补髓生血颗粒治疗阴虚型CAA患者的有效率为68.00%，治疗阳虚患者的有效率为89.25%[4]；张守琳等[5]对32例CAA患者进行临床观察，应用补髓生血颗粒治疗后的总有效率为75.0%；李志侠[6]对30例CAA患者的临床研究发现，补髓生血颗粒治疗CAA的总有效率为79.99%；刘娜等[7]对67例CAA患者展开研究，发现补髓生血颗粒治疗CAA疗效较好，能明显改善患者不适症状，提高中医证候平均积分，改善骨髓增生程度，提高患者的血红蛋白及白细胞计数水平，以上研究结果均提示了补髓生血颗粒治疗CAA的疗效显著。

骨髓为血液的主要制造场所。中医学认为，人始生，先成精，精成而脑髓生，骨为干，脉为营，血乃成。髓劳病的发病主要是肾精亏虚，肾阴亏损，阴损及阳，肾阳不振，则骨髓无力造血，阴不制阳，虚热内生，熬精耗液，阴损更甚，日久则精竭髓枯，如此往复，恶性循环。补髓生血颗粒对CAA的治疗主要是通过补肾生血的方法来达到治疗目的。该药根据中医肾藏精、精生髓、精血同源的理论，采用补肾填精益髓之法，滋阴壮阳，补肾填精[8]。方中应用熟地黄、山茱萸、枸杞子等滋阴补肾养血；淫羊藿、巴戟天等补肾益气壮阳，黄芪、人参大补元气、生精化血，丹参、鸡血藤等活血化瘀、去瘀生新，白花蛇舌草、猪苓清热解毒。在应用补髓生血颗粒治疗CAA的过程中，我们发现补肾生血中药可以通过调节细胞的黏附分子，进而调节造血微环境，促进骨髓造血功能的重塑。

整合素是细胞表面糖蛋白受体的主要家族[9]，是细胞识别的重要途径。整合素在体内表达广泛，在生命活动中扮演着至关重要的角色，它能够介导细胞和细胞外基质的黏附情况，还能够诱导各细胞间的相互作用。其中成员最多的为β1整合素，VLA-4和VLA-5则是β1整合素家族中激活晚期出现的VLA亚家族成员。VLA-4一般表达于各种淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞的表面，能够穿过相应配体到达炎症部位，在淋巴细胞的解析、生存、迁移、分化、归巢等多种细胞生命活动中起到较为关键的作用[10]。VLA-5能够参与细胞与细胞外基质的黏附作用，促进造血细胞的分化和生长。

CAA患者发病时VLA-4呈低表达状态，说明VLA-4可能参与了CAA的造血微环境的发病机制[11]。VLA-4与调节造血干/祖细胞和骨髓基质细胞之间的黏附作用有关。有研究[12]显示，黏附分子VLA-4能够结合多种配体，既能介导细胞间的相互作用，又能介导细胞内外的黏附信息，是介导造血干细胞与骨髓黏附能力较为重要的受体。纤维连接蛋白（FN）是骨髓基质的主要组成成分，与VLA-4相结合可以介导骨髓干细胞与骨髓微环境的黏附作用，使干细胞固定于骨髓中的某个位置，从而引起细胞的增殖和分化。本次研究中，治疗前CAA患者骨髓黏附分子VLA-4mRNA表达低于正常对照组，经治疗6个月后，患者VLA-4 mRNA表达水平上升，差异有统计学意义（P＜0.05）。研究结果提示，当VLA-4mRNA呈低表达时，抑制了骨髓造血干/祖细胞的增殖和分化，可能导致CAA的发病。补髓生血颗粒通过对VLA-4mRNA黏附表达功能的调节，进而促进骨髓造血干/祖细胞的增殖和分化。

VLA-5是整合素亚家族成员之一，能够促进造血细胞的进一步分化。用特异性抗体、细胞因子白细胞介素3（IL-3）、粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和干细胞生长因子抗体（SCF），或蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）的激活物处理造血细胞，可增强VLA-5mRNA与其他配体结合的能力。VLA-5主要作用在细胞以及细胞外基质当中，与细胞的分化和走行息息相关。VLA-5在造血祖细胞居于骨髓过程中发挥作用，可能具有增强造血细胞生长的功能。在本次研究中，CAA患者骨髓单个核细胞黏附分子VLA-5mRNA高于正常表达，有可能参与了造血调节机制，对造血起到负调控作用，使细胞出现凋亡，从而导致CAA的发生。补髓生血颗粒通过调节VLA-5 mRNA的黏附表达功能，抑制了细胞凋亡，改善黏附功能，促进造血，改善CAA患者贫血的状态。

杜华等[13]报道，根据VLA-4mRNA和VLA-5 mRNA对细胞外基质的影响，干细胞可迅速穿过细胞外基质迁移至骨髓腔内的干细胞龛附近，协助造血细胞黏附并定位于微环境中，促进造血干细胞和基质细胞聚合，完成造血干细胞的迁移和归巢。在本次研究中，我们推测当VLA-4mRNA发生低表达、VLA-5mRNA发生高表达时，可能使造血干细胞的功能发生改变，导致造血细胞的黏附功能发生异常，使其归巢能力、瞄定微环境能力下降，导致造血干细胞的增殖和分化能力降低，从而致使CAA发生。应用补髓生血颗粒，可能会平衡VLA-4mRNA和VLA-5mRNA黏附功能的表达，使低表达的VLA-4mRNA水平升高和高表达的VLA-5mRNA水平降低，虽未恢复至正常对照组水平，但对骨髓造血功能的改善则是显而易见的。补髓生血颗粒可能通过促进造血干细胞的自我复制能力，增强细胞增殖和分化的能力，修复和改善骨髓微环境，为骨髓基质细胞的生长创造良好的生存环境。因此，应用补髓生血颗粒治疗CAA，能够刺激造血干/祖细胞的自我复制功能和增殖分化能力[14]，改善骨髓微环境的状态，有利于促进骨髓基质细胞的生长。

综上所述，CAA患者服用补髓生血颗粒后骨髓VLA-4mRNA、VLA-5mRNA的表达水平有比较明显的改善，补髓生血颗粒可能通过促进β1整合素的某些黏附因子发挥其作用，从而改善造血微环境，达到促进骨髓造血干/祖细胞增殖和分化的治疗目的。