加味济生肾气汤对链脲佐菌素诱导的糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用

江波， 孙勤国， 谢萍， 施燕， 黄天慧

（1.武汉大学同仁医院/武汉市第三医院中医科，湖北武汉430060；2.湖北中医药大学，湖北武汉430065）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病（diabetesmellitus，DM）的慢性微血管并发症，也是最终导致糖尿病患者死亡的重要原因[1]。其在糖尿病并发症中占30%～40%[2]。因此，加强糖尿病及其并发症糖尿病肾病的治疗研究具有重要意义。中医药治疗糖尿病肾病具有疗效温和、持久、不良反应少的优点。济生肾气丸出自宋代严用和《济生方》，有温肾阳、散瘀结、行气利水的作用[3]。本课题组以此方为基础加减变化，临床应用加味济生肾气汤治疗糖尿病肾病有明显疗效，但其作用机制尚不清楚。故本研究观察不同剂量的加味济生肾气汤对链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病肾病大鼠肾脏功能的保护作用，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物66只SPF级日龄90 d雌性SD大鼠，体质量为（232.5±14.3）g，购于湖北省疾病预防控制中心，动物质量合格证号：42000600026493。饲养于华中农业大学实验动物中心，室温23℃左右，自然光源，自由饮水。

1.2 药物 加味济生肾气汤方药组成：肉桂6 g，制附片8 g，熟地15 g，山药25 g，山茱萸15 g，茯苓20 g，泽泻8 g，丹皮8 g，怀牛膝15 g，车前子10 g，黄芪25 g，熟大黄8 g，桃仁10 g，穿山甲25 g。方中中药材均采购于武汉市第三医院药学部。加水1 000mL，水煎2遍，煎煮至200mL备用。

1.3 试剂与仪器 链脲佐菌素（STZ）（购于北京索莱宝科技有限公司）；血糖酶联免疫吸附分析（ELISA）测试盒、胰岛素（INS）ELISA测试盒、糖化血红蛋白（HbA1c）ELISA测试盒、尿素氮（BUN）ELISA测试盒、内皮素（ET-1）ELISA测试盒、微量白蛋白尿（UmAlb）ELISA测试盒、ELISA测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；血清胱抑素C（Cys-C）ELISA测试盒（上海抚生实业有限公司）；血肌酐（SCr）ELISA测试盒（上海纪宁实业有限公司）。ELx800TM酶标仪（美国Bio-Tek公司）；Leica RM2235石蜡切片机（中国上海徕卡公司）。

1.4 分组、造模与给药 将大鼠随机分成正常组（N=11），造模组（N=55）。2组适应性喂养7 d后，进行模型的构建和相应处理。造模方法：给予大鼠喂养高糖高脂饲料（含猪油20%、白糖20%、蛋黄粉6%、基础饲料54%）5周后，禁食12 h，腹腔注射剂量为25 mg/kg的链脲佐菌素（STZ），每天1次，注射3 d。检测空腹血糖（FBG），FBG含量＞11mmol/L，即表明糖尿病肾病模型复制成功[4]。统计成模率，未成模者予剔除实验。再将造模成功的大鼠随机分为模型组、羟苯磺酸钙组，中药低、中、高剂量组。将备用的加味济生肾气汤按照灌胃剂量稀释到10mL，中药低、中、高剂量组给予加味济生肾气汤（剂量分别为0.94、3.76、9.40 g·kg-1·d-1）灌胃。羟苯磺酸钙组灌胃羟苯磺酸钙100mg·kg-1·d-1。正常组、模型组等体积生理盐水灌胃。每天1次，连续6周。

1.5 观察指标与方法

1.5.1 观察大鼠一般情况 观察大鼠精神状态、毛色、饮水量、摄食量、尿量，统计并记录各组大鼠体质量，对外界刺激的反应、死亡情况等。

1.5.2 免疫比浊法检测24 h尿微量白蛋白（24hUmAlb）含量 采用代谢笼收集动物24 h尿液（每笼动物3～5只），计量尿量。按尿总蛋白测定试剂盒说明书操作，简要步骤如下：使用8孔板，每孔加入200μL试剂R1，之后每孔加入10μL样品或者标准品，37℃下孵育10min，于600 nm处读取吸光度（D）。按标准品绘制出的标准曲线计算样品尿蛋白浓度。平均每只动物的24 h尿蛋白总量=样品尿蛋白浓度×尿量/动物只数。

1.5.3 ELISA法检测FBG、INS、BUN、SCr、Cys-C、ET-1、HbA1c水平 药物干预结束、空腹12 h后，给予大鼠100 g/mL水合氯醛腹腔注射麻醉（剂量为0.3mL/100 g）。用组织剪沿腹中线剪开皮肤、肌肉，充分暴露腹腔，进行腹主动脉采血。以3 000 r/min离心10min，分离血浆和血清，抗凝标本。血浆用于HbA1c检测，血清用于BUN、SCr、Cys-C、ET-1的检测，所有检测均在室温下2 h内检测完毕。ELISA法操作步骤：根据试剂盒说明书稀释标准品。绘制标准曲线。在酶标包被板上设标准品孔，依次加入不同浓度的标准品50μL。分别设空白孔（空白对照孔不加样品、酶标试剂及生物素标记的抗体，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品40μL，然后再加生物素标记的抗体10μL。将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外。用封板膜封板后置37℃温育30min。将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干。每孔先加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10min。每孔加终止液50μL，终止反应。

1.5.4 苏木素—伊红（HE）染色观察肾组织病理变化 将大鼠肾脏组织经过脱水，包埋，以6μm的厚度均匀切片。将苏木精加入蒸馏水内加温溶解，冷却后加入酒精和甘油，备用。石蜡切片脱蜡至水。用苏木精液染核7min。置于容器中，流水冲洗2 h。以1%的盐酸酒精溶液分化3 s，用伊红染液染色5～10min。用体积分数95%酒精、无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.6 统计方法 采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析。计量数据以均数±标准差（）表示，多组比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 糖尿病肾病大鼠成模率55只大鼠，共有47只大鼠造模成功，其中8只大鼠注射STZ后血糖仍未达到16.7mmol/L，予以剔除，成模率为85.5%。0只大鼠在高糖高脂饲料喂养期间死亡。中药中剂量组1只在STZ注射后，药物治疗第5周死亡，死亡率为2%。最终共46只大鼠参与造模后的实验，其中：模型组，10只；羟苯磺酸钙组，9只；中药低剂量组，10只；中药中剂量组，9只；中药高剂量组，9只。

2.2 各组大鼠一般情况比较 正常组大鼠精神状态良好，毛发浓密均匀有光泽，反应灵敏，体质量显著增加。模型组大鼠精神状态较差，反应缓慢，毛发粗糙而凌乱无光泽，多饮、多食、多尿症状比较明显，形体消瘦。中药高、中、低剂量组和羟苯磺酸钙组大鼠精神状态、活动以及反应情况略差于正常组大鼠，体质量增长速度较慢，后期上述症状有所缓解。

2.3 治疗结束后各组大鼠体质量值比较 在治疗第5周结束时，检测各组大鼠的体质量值，结果见图1。与正常组比较，模型组大鼠体质量显著降低（P＜0.05）。与模型组比较，羟苯磺酸钙组，中药中、高剂量组大鼠体质量显著升高（P＜0.05）；中药低剂量组大鼠体质量与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。提示加味济生肾气汤可提高糖尿病肾病大鼠体质量，且呈剂量依赖性。

图1 治疗结束后各组大鼠体质量值比较Figure 1 Com parison of the ratbodymass values in various groups after treatmentending（）

2.4 各组大鼠FBG、INS水平比较 图2结果显示：与正常组比较，模型组大鼠FBG、INS水平均显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，中药低、中、高剂量组和羟苯磺酸钙组大鼠FBG、INS水平均显著降低（P＜0.05）。提示加味济生肾气汤可改善糖尿病肾病大鼠FBG、INS水平，且呈剂量依赖性。

2.5 各组大鼠肾功能比较 图3结果显示：与正常组比较，模型组大鼠BUN、SCr、Cys-C、ET-1、HbA1c及24hUmAlb水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，中药低、中、高剂量组和羟苯磺酸钙组的BUN、SCr、Cys-C、ET-1、HbA1c及24hUmAlb水平均显著降低（P＜0.05）。提示加味济生肾气汤可改善糖尿病肾病大鼠肾功能，且呈剂量依赖性。

图2 各组大鼠FBG、INS水平比较Figure 2 Com parison of the levels of FBG and INS in various groups（）

2.6 各组大鼠肾组织病理变化比较 图4结果显示：模型组肾小球体积增加，系膜细胞和系膜基质增生，系膜区变宽，基底膜增厚，毛细血管环增多，肾小管上皮细胞肿胀，融合，坏死，肾小球系膜区大量炎性细胞浸润。中药中、高剂量组以上症状均得到明显改善，中药低剂量组改善不明显。

3 讨论

图3 各组大鼠肾功能比较Figure 3 Com parison of the renal function in various groups（）

图4 各组大鼠肾组织病理变化比较（HE染色，×200）Figure 4 Com parison of the pathologicalchanges of kidney tissues in various groups（by HE staining，×200）

糖尿病肾病是糖尿病的严重并发症之一，缺乏有效治疗和控制会导致终末期肾病（ESRD）的发生[5，6]。早期糖尿病肾病最常见的临床表现之一是尿白蛋白排出量的增加[7]，一旦出现临床蛋白尿[尿微量白蛋白（UmAlb）＞0.5 g/24 h]，肾小球功能则呈进行性下降，若出现大量蛋白尿，则逐渐出现肾功能损害。24 hUmAlb为糖尿病肾病严重程度的衡量标志之一，加速肾脏病变的进展，因此降低蛋白尿可以减少肾脏的持续损伤[8-10]。血液生化指标BUN、SCr常用于指示糖尿病肾病炎性和肾脏功能状态。SCr水平的升高、体质量的增加、血糖的升高等都是蛋白尿发生的重要危险因素。本研究结果显示，加味济生肾气汤可显著降低糖尿病肾病大鼠BUN、SCr、24 hUmAlb水平，提示加味济生肾气汤可有效改善糖尿病肾病大鼠肾功能。

Cys-C是由122个氨基酸组成的相对分子质量约为13 kDa的低分子蛋白质，广泛存在于体液和有核细胞内[11]。亦是一种不受血脂、年龄等干扰的半胱氨酸蛋白酶抑制物，能自由地通过肾小球，在近曲小管处被降解，不再回到血液中。肾小管不能分泌Cys-C，肾脏是清除Cys-C在体内循环的唯一器官，故Cys-C可作为评价肾功能的指标[12，13]，能够很好地反映肾脏的滤过功能。本研究结果显示，加味济生肾气汤可显著降低Cys-C的含量，提示加味济生肾气汤能提高STZ诱导糖尿病肾病大鼠肾脏的滤过功能。

内皮素（ET-1）是作用最强的血管舒缩因子之一，与糖尿病早期肾小管间质损伤密切相关[14，15]，正常生理情况下，ET-1水平很低，但在病理状态下，高血糖、高脂血症或受刺激后ET-1局部合成增多[16]。HbA1c和肾小球滤过率的纵向变化可精确地预测早期糖尿病肾病的发生，HbA1c能反映1～2个月前的平均血糖水平，是反映糖尿病较长时间血糖控制水平的良好指标[17-19]。本研究发现，ET-1和HbA1c水平在正常组、中药高剂量组、中剂量组、低剂量组和模型组间呈现依次升高的变化趋势。说明加味济生肾气汤对STZ诱导糖尿病肾病大鼠肾脏具有保护作用。在病理组织学方面，加味济生肾气汤可明显改善糖尿病肾病大鼠肾组织病理损伤。