川骨片对家兔激素性股骨头缺血性坏死ERK1/2、JNK、p38磷酸化蛋白的影响

周毅， 杨世鹏， 赵智慧， 陈靖文， 张雄卫， 周天， 江中潮

（1.成都中医药大学附属医院，四川成都 610075；2.重庆市中医骨科医院，重庆 400010；3.成都中医药大学，四川成都 610075）

激素性股骨头缺血性坏死（steroid induced avascular necrosis of the femoral head，SANFH）是由于糖皮质激素大量使用导致骨内循环障碍、骨代谢失衡、破骨细胞增多而成骨细胞凋亡，破坏股骨头局部血运，引起缺血、坏死，继而导致股骨头塌陷、骨折的一种骨疾病。近年来，由于糖皮质激素在临床治疗中的滥用，SANFH的发病率日渐增高，占非创伤性股骨头坏死的首位，起病隐袭，病情发展较快，致残性强，已成为困扰医患的重大公共难题之一[1，2]。本院院内制剂川骨片对SANFH有显著临床疗效，但其机制尚不明确。分裂原活化蛋白激酶（MAPK）是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，对细胞的生长、分化、炎症反应等具有调节作用[3]。本研究以SANFH家兔模型为研究对象，观察川骨片对MAPK信号通路主要成员蛋白细胞外信号调节激酶（ERK）1/2、c-Jun N-末端激酶（JNK）和p38表达的影响，探讨其作用机制，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物清洁级健康雄性日本大耳兔56只，体质量2.0～2.5 kg，由成都中医药大学实验中心提供（许可证号：川实动管第99011号），检疫合格备用。本研究动物饲养及动物实验均在成都中医药大学实验中心完成，室内保持恒定温度及湿度，相对湿度为45%～60%。

1.2实验药物及制备川骨片，由续断、骨碎补、黄芪、淫羊藿、肉苁蓉、熟地、丹参、菟丝子、枸杞、补骨脂、杜仲、当归、牛膝、乳香、没药、红花、独活、威灵仙、白术、茯苓、甘草等组成，由成都中医药大学附属医院生产，批准文号：川药制字Z20070657。仙灵骨葆胶囊（贵州同济堂制药有限公司，批准文号：国药准字Z20025337），主要由淫羊藿、续断、丹参、知母、补骨脂、地黄等组成，研究已证明本品能抑制破骨细胞的吸收活动，加快骨再建活动，刺激骨形成，提高骨密度，是临床上用于股骨头坏死治疗的有效制剂，本实验中作为阳性对照药物进行研究。将川骨片（规格：0.3 g/片）使用蒸馏水熬制为水剂，制备为生药量0.6 g/mL混悬液体。将仙灵骨葆胶囊（规格：0.5 g/粒）用蒸馏水熬制为水剂，制备为含成药仙灵骨葆胶囊0.6 g/mL的混悬药液。药液均于0～4℃保存备用。以上药液制备委托成都中医药大学附属医院制药车间完成。醋酸泼尼松龙（华中药业股份有限公司，规格：5 mL∶0.125 g，生产批号：20171203）。

1.3主要试剂与仪器p-ERK1/2、p-JNK和p-p38抗体（美国CST公司）；GAPDH（武汉普健生物公司）。BCA蛋白定量检测试剂盒、RIPA lysis buffer（上海碧云天公司）；十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶制备试剂盒（武汉普健生物公司）；蛋白预染marker（美国Thermo Scientific公司）。TVO.63XC-MO HE染色成像系统（广州明美公司）；PP1152电泳仪（上海CAVOY公司）；EPS600C电转仪（上海天能公司）；TS-8S脱色摇床（江苏其林贝尔公司）；ChemiDocTMXRS+凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；PerkinElmer全功能微孔板检测仪（美国PerkinElmer公司）。

1.4分组与造模将56只雄性大耳兔随机分成2组，即空白组（16只）和造模组（40只）。适应性喂养1周后，造模组采用贺西京造模法复制SANFH模型[4]：于兔右侧臀部肌肉注射醋酸泼尼松龙8 mg/kg，每周2次，连续注射6周。空白组右侧臀肌注射等量生理盐水，每周2次，连续注射6周。所有动物左侧臀肌预防性注射青霉素8万U/kg，预防感染，每周2次，共6周。6周后处死空白组4只和模型组4只进行模型鉴定。在无菌条件下取出右侧股骨头，采用苏木素—伊红（HE）染色，于光镜下观察骨小梁、骨细胞、髓腔及造血细胞形态、结构和数量的变化，并在股骨头软骨下区骨组织上随机选择10个高倍视野，计算每个视野中所有骨陷窝数和空骨陷窝数，计算出空骨陷窝率，判断造模是否成功。空骨陷窝率=空骨陷窝数/全部骨陷窝数×100%。

1.5给药方法造模成功后剩余的36只造模组兔再随机分为模型对照组、川骨片治疗组、仙灵骨葆胶囊治疗组，每组12只。按成人60 kg体质量换算法[5]换算，川骨片治疗组给予川骨片（剂量为0.6 g·kg-1·d-1）灌胃，仙灵骨葆胶囊治疗组给予仙灵骨葆胶囊（剂量为0.6 g·kg-1·d-1）灌胃，模型对照组给予蒸馏水1 mL/kg灌胃，空白组不做任何处理，连续灌胃42 d。

1.6观察指标与方法

1.6.1 取材 采用空气栓塞法处死各组家兔，在无菌条件下取出家兔右侧股骨，取下股骨头冠状面剖开分别置于40 g/L多聚甲醛、液氮中保存备用。

1.6.2 光镜观察股骨头组织形态 将组织放入配好的混合酸脱钙液中进行脱钙，脱水机内依次梯度酒精进行脱水，浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋，石蜡切片机切片，片厚4μm，HE染色，树胶封片供镜检。

1.6.3 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测股骨头组织p-ERK1/2、p-JNK和p-p38蛋白表达 将组织剪碎，加入配制好的RIPA裂解液中，然后进行离心等处理，用BCA试剂盒检测总蛋白含量。12%十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）分离蛋白，电转移至PVDF膜上，一抗（p-ERK1/2 1∶2 000稀释，p-JNK 1∶1 000稀释，pp38 1∶1 000稀释，GAPDH 1∶5 000稀释）4℃过夜孵育，室温二抗孵育1 h，ECL化学发光试剂盒显影，洗片。胶片经扫描仪扫描后获得图像。用Image J软件计算目的蛋白条带与内参GAPDH蛋白条带的灰度比值（p）。

1.7统计方法采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（-x±s）表示，组间比较用单因素方差分析，股骨空骨陷窝率（p/%）组间比较采用卡方检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1家兔股骨头光镜镜检结果空白组：软骨细胞以及骨细胞基质红染，染色均匀，软骨细胞排列规则整齐，组织结构清晰可见，潮线完整。股骨头部骨小梁完整无明显变形、断裂，排列规则，骨组织内可见大量活跃的成骨细胞，骨陷窝稀少，滋养血管丰富，髓腔内可见大量形态规则的造血细胞，整个组织的结构完整，其中仅可见极少的脂肪细胞。模型对照组：软骨细胞破坏明显，细胞变形，不规则，整个软骨层组织排列粗糙不平整，可见较宽的细胞间隙直达深层组织，部分动物可见股骨头软骨细胞完全剥离，软骨组织结构模糊不清，潮线明显中断。骨组织的骨小梁变细，稀疏，排列不规则，结构紊乱，骨小梁之间的间距增宽，骨髓内中可见大量分布的脂肪细胞，而骨细胞则变形萎缩，在组织边缘聚集，组织内可见大量骨陷窝存在。川骨片治疗组：镜下可见关节软骨轻度变性，软骨表面细胞排列不规则，粗糙不整，软骨下骨组织内可见较丰富的血管分布，骨组织的四层结构基本清晰，潮线不连续，镜下可见少量炎性细胞增生，骨小梁较模型对照组粗大，骨髓腔内可见造血细胞散在分布，大部分的骨细胞形态结构正常，骨组织内镜下可见的空骨陷窝较模型对照组有所减少。仙灵骨葆胶囊治疗组：镜下可见关节软骨轻度变性，软骨表面细胞排列不规则，粗糙不整，软骨下骨组织内可见较丰富的血管分布，骨组织的四层结构基本清晰，潮线不连续，镜下可见少量炎性细胞增生，骨小梁较模型对照组粗大，骨髓腔内可见造血细胞散在分布，大部分的骨细胞形态结构正常，骨组织内镜下可见的空骨陷窝较模型对照组有所减少。结果见图1。

图1 家兔股骨头组织光镜镜检报告（HE染色，×200）Figure 1 Light microscope of rabbit femoralhead tissue（by HE staining，×200）

图2 造模组与空白组家兔股骨空骨陷窝率比较Figure 2 Comparison of the rate of empty bone lacuna in the modeling group and blank group

图3 各组家兔第13周股骨空骨陷窝率比较Figure 3 Comparison of hollow bone lacuna rate in various groups on the 13th week

表3 各组家兔股骨头组织p-ERK1/2、p-JNK、p-p38表达比较Table 3 Comparison of the expression levels of p-ERK1/2，p-JNK，p-p38 in rabbit femoral head tissue of various groups （，p）

表3 各组家兔股骨头组织p-ERK1/2、p-JNK、p-p38表达比较Table 3 Comparison of the expression levels of p-ERK1/2，p-JNK，p-p38 in rabbit femoral head tissue of various groups （，p）

①P＜0.01，与空白组比较；②P＜0.01，与模型对照组比较

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2.2各组家兔股骨空骨陷窝率比较图2结果显示：造模组家兔股骨空骨陷窝率明显高于空白组（P＜0.05）。表明糖皮质类激素可以导致骨细胞的破坏，导致空骨陷窝率明显升高。提示实验前期造模成功。图3结果显示：第13周时，与模型对照组比较，川骨片治疗组、仙灵骨葆胶囊治疗组的空骨陷窝率明显较低，差异有统计学意义（P＜0.05）；川骨片治疗组空骨陷窝率与仙灵骨葆胶囊治疗组比较，差异无统计学意义（P＞0.0.5）。

2.3各组家兔股骨头组织p-ERK1/2、p-JNK、p-p38表达比较表3、图4结果显示：与空白组比较，模型对照组家兔股骨头组织p-ERK1/2蛋白表达水平显著下降（P＜0.05），p-JNK、p-p38蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；与模型组对照比较，川骨片、仙灵骨葆胶囊治疗组家兔股骨头组织p-ERK1/2蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），p-JNK、p-p38蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），而川骨片治疗组p-ERK1/2、p-JNK、p-p38表达水平与仙灵骨葆胶囊治疗组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图4 p-ERK1/2、p-JNK、p-p38蛋白电泳条带Figure 4 Electrophoresis strips of p-ERK1/2，p-JNK and p-p38 proteins in various groups

3 讨论

目前，激素性股骨头缺血性坏死（SANFH）的发病机制仍不明确，存在高凝低纤溶微血管血栓栓塞学说、脂肪代谢紊乱学说、骨内高压学说、二次碰撞学说、遗传以及基因多态性学说等[6-8]。但股骨头缺血坏死的发病机制更多集中于分子生物学水平细胞增殖、分化、凋亡的研究。MAPK通路在促进细胞增殖、分化、抑制其凋亡中发挥重要作用。ERK1/2、p38、JNK是MAPK家族的主要成员。活化的MAPK通过级联反应将外界信号传递给细胞核，通过作用于AIF-2、cMyc等转录因子，调节与细胞增殖、分化相关的基因表达[9]。其中最早发现的Ras-Raf-MAPK经典信号转导途径是ERK1/2信号通路，ERK1、ERK2、ERK3、ERK4和ERK5是它的5个亚组，其中ERK1和ERK2是2个高度同源的亚类，它们的分子质量分别是44 kDa和42 kDa，它们在增殖过程中起着重要作用，却在分化过程中作用不明显[10]。Raf家族属于促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶（MAPKKK），当Raf被激活，其后使MEK1/2磷酸化，最终磷酸化激活ERK1/2。被激活的ERK1/2转位至核内，引起细胞生长、增殖与分化。

JNK、p38 MAPK通路是细胞应激反应诱导细胞凋亡的主要信号转导途径。p38的信号传递通路是通过4种激酶构成的反应链。当细胞受体接收到刺激后，会激活细胞膜上的受体，通过蛋白的磷酸化作用调节p38的蛋白表达，进而使细胞外的信号传递到细胞核内靶向目标，通过调节相关基因蛋白的表达影响正常细胞的代谢[11，12]。JNK家族包含有3种基因编码，分别为JNK1、JNK2和JNK3。细胞因子、应激反应等细胞内或者细胞外的刺激都能使JNK信号通路活化[13]。JNK信号传导通路的具体激活过程机制非常复杂，并且其与ERK和p38等信号通路也有着相互的作用和密切的联系，是机体中细胞代谢过程的一个必不可少的重要调节点。Yoon等[14]研究肿瘤坏死因子α（TNF-α）作用于机体软骨细胞时发现，软骨细胞的代谢过程中JNK信号通路是必不可少的一个调控环节。可见，JNK信号通路在细胞的代谢过程中起着重要的作用，影响着细胞的生成与凋亡。

糖皮质激素为现代医学名称，归属中医“药邪”的范畴，为“纯阳”之品，易损伤肾阴肾精[15]。大剂量或长期服用糖皮质激素而致肝脾肾等脏器受损，肝肾不足，脾失健运，聚湿生痰，痰湿蕴结，流注关节，胶着粘滞，日久则痰瘀互结，阻于骨骸、经脉，筋骨失荣，骨肉不相亲，乃至骨枯髓空，发为SANFH。故本病病机为肝脾肾三脏亏虚为本，痰瘀互结为标[16]。本院的院内制剂川骨片中续断、骨碎补、熟地黄、枸杞、杜仲、淫羊霍、补骨脂填精益髓，黄芪、白术、茯苓等补气健脾，当归、红花、乳香、没药、丹参、牛膝等活血补血。全方起到填精益血、祛瘀通络、气血同治、调营和卫、攻补兼施之功效，攻不伐正，补不滋腻，骨络疏通，使股骨头得到气血滋养。其临床治疗SANFH取得了显著的疗效。有研究表明，仙灵骨葆胶囊可通过上调血清护骨素（OPG）的表达、下调核因子κB受体活化因子配体（RANKL）的表达，提高OPG/RANKL比例，进而改善骨代谢[17]，为SANFH的治疗提供了有效的方法。故本研究以仙灵骨葆胶囊为阳性对照药。

本实验研究结果显示，川骨片、仙灵骨葆胶囊治疗组家兔股骨头光镜镜检报告及股骨空骨陷窝率均较模型组明显改善。川骨片、仙灵骨葆胶囊治疗组家兔股骨头组织p-ERK1/2蛋白表达有显著升高（P＜0.05），p-JNK、p-p38蛋白表达显著降低（P＜0.05），但川骨片治疗组p-ERK1/2、p-JNK、p-p38与仙灵骨葆胶囊治疗组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。推测川骨片可能是通过上调SANFH家兔股骨头组织ERK1/2的表达，下调JNK、p38的表达，从而促进新骨的形成，抑制骨的破坏，促进骨坏死的修复，达到治疗SANFH的目的。