microRNA-21靶向cdc4影响人卵巢癌干细胞生物学效应的价值

谭长安 郭金珠

卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)是常见的妇科肿瘤，发现时大多已处于疾病晚期，因此死亡率比较高[1-2]。并且卵巢癌干细胞具有高度恶性的生物学行为，容易发生侵袭转移，严重威胁着妇女的身心健康[3-4]。放化疗为晚期卵巢癌的常见治疗方法，但是治疗后容易复发[5]。microRNA(miRNA)是近年来在真核生物中发现的一类长度约为22个核苷酸的非编码的小RNA分子，miRNA可通过靶向作用于多种肿瘤抑制基因，对肿瘤肝细胞的生长、转移等有调节作用[6-7]。miRNA在肿瘤中的表达往往是失调的，与其他肿瘤相似，卵巢癌也有其特异的miRNA表达谱，miRNA可通过靶向作用于多种肿瘤抑制基因或转移抑制基因，调节卵巢癌的生长、侵袭和转移[8]。MicroRNA-21(miR-21)是在肺癌、肝癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、胃癌等多种癌组织中过高表达[9]，在肿瘤各个阶段演变过程中，伴随有信号传导基因、抑癌基因、致癌基因等异常表达，也存在凋亡受阻、增殖侵袭、失控、转移等异常变化等[10]。细胞分裂周期蛋白4(cell division cyclin 4，cdc4)是1种细胞分裂周期蛋白质，是控制细胞周期进入M期的关键因子之一，在真核生物的细胞有丝分裂中起重要调节作用[11]。本文具体探讨了miR-21靶向cdc4影响人卵巢癌干细胞生物学效应的价值，希望为卵巢癌的防治提供可能的靶点。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

转染试剂Lipo2000、凋亡试剂盒、Trizol、FBS胎牛血清、青霉素/链霉素、0.25%胰酶、CCK-8检测试剂盒、DMEM培养液(美国GIBCO)，蛋白质提取试剂、6×上样缓冲液、ECL检测试剂盒、蛋白BCA定量试剂盒(日本TaKaRa)，miR-21 mimics、miRNA阴性对照(NC)、miR-21 inhibitor(上海吉玛)，IGF-1抗体、GAPDH抗体(美国abcam)；卵巢癌干细胞OVCAR3。

制冰机、低温冰箱(日本SANYO)，细胞培养箱、培养瓶、培养皿、培养板、离心管(美国sigma)，台式离心机(上海奥豪斯)，电泳仪(美国Bio-RAD)。

卵巢癌干细胞OVCAR3细胞株(中国医学科学院基础医学研究所)。

1.2 细胞培养与转染

实验分组：miR-21 inhibitor组、miR-21 inhibitor NC组、miR-21 mimic组、miR-21 mimic NC组、blank组。

采用脂质体细胞进行转染，转染前1天，5000个/孔卵巢癌干细胞OVCAR3接种于96孔板上，细胞生长密度在24 h后约为80.0%，在100 μl的无血清培养基中加入6 pmol 的样本(miR-21 inhibitor、miR-21 inhibitor NC、miR-21 mimic、miR-21 mimic NC)进行转染，转染体系终体积200 μl，转染样本的终浓度30 nM，每个样本设置3个复孔。

1.3 细胞增殖、细胞凋亡检测

在细胞转染后48 h进行细胞活性的检测，加入10 μl 的CCK-8试剂，孵育2 h，用酶标仪测定每孔在波长为450 nm处的吸光度，计算相对增殖活性。同时将手记细胞重悬在AnnexinV 结合缓冲液中，稀释至1×106个细胞/ml；取100 μl 细胞悬液加入和5 μl Alexa Fluor 488 Annexin V 工作液和1 μ 100 μg/ml 的PI，避光室温孵育15 min；然后加入400 μl AnnexinV 结合缓冲液，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.4 细胞周期检测

细胞转染后48 h，取细胞样本进行固定，用PBS洗2次，加入100 μl PBS后混匀，同时加入等体积的碘化丙锭染液低温(4 ℃)混合，尼龙膜过滤后上流式细胞仪检测细胞周期。

1.5 cdc4的表达检测

细胞转染后48 h，收集细胞，加入细胞裂解液，在冰上静置30 min，使细胞充分裂解，4 ℃ 14 000 rpm 离心10 min，取上清蛋白液。使用BCA 法检测蛋白样品的浓度，经过电泳、转膜、封闭、孵一抗、孵二抗、ECL发光等步骤，根据曝光所得条带的灰度值分析cdc4蛋白的表达水平(actin为内参)。

上述所有实验重复三次，每个样品取3个平行。

1.6 统计学方法

应用统计软件GraphPad prism 6.0与SPSS 22.00进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差表示，对比方法主要为方差分析、t检验、LSD-t检验等，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 转染后miR-21表达水平对比

以blank组为参照，转染细胞48 h后，qRT-PCR检测显示mimic组、mimic NC组、inhibitor组、inhibitor NC组的miR-21的相对表达量分别为10.49±2.18，1.29±0.55，0.20±0.08，1.39±0.19，对比差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 细胞增殖与凋亡水平对比

转染细胞48 h后，mimic组比mimic NC组细胞的增殖活性下降，inhibitor组比inhibitor NC组细胞的增殖活性增强，对比差异有统计学意义(P<0.05)；mimic组、mimic NC组、inhibitor组、inhibitor NC组、blank组凋亡率分别为(40.00±3.18)%、(18.19±2.01)%、(7.44±1.11)%、(18.11±1.86)%、(17.22±3.84)%，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 不同组别转染后不同时间点的细胞增殖与凋亡水平对比

注：*为与相应的NC组相比，P<0.05。

2.3 细胞周期状况对比

转染细胞48 h后，mimic组的G0/G1期细胞数目显著高于blank组与mimic NC组，S、G2/M期细胞数目显著减少(P<0.05)。见表2。

2.4 cdc4蛋白表达水平对比

转染细胞48 h后，cdc4蛋白在mimic组、mimic NC组、inhibitor组、inhibitor NC组、blank组中的相对表达水平分别为0.45±0.22，1.45±0.14，3.89±0.11，1.66±0.33，1.74±0.32，对比差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 不同组别的细胞周期状况对比

注：*为与相应的NC组相比，P<0.05。

3 讨论

卵巢癌是高度恶性的妇科肿瘤，在女性生殖系统恶性肿瘤中发病率次于宫颈癌和乳腺癌，且其易发生广泛的腹腔内种植播散，临床死亡率比较高[12]。虽然根治卵巢癌的方法是早期手术切除，但大部分患者在确诊时已发生远处转移，失去了手术治疗的指征[13]。目前对于卵巢癌病理与预后因素的研究已日趋成熟，但是有关其分析发病机制方面没有定论。

miRNA是1类内源性的非编码的小分子RNA，其参与细胞增殖、凋亡、肿瘤发生及侵袭、转移、血管生成等过程，且具有重要的调控作用[14]。miRNA是重要的转录后调控因子，其可作为癌基因或抑癌基因发挥作用，特别是其异常表达可参与了肿瘤的发生和发展。miR-21 mimic的导入能够模拟细胞内的内源性miR-21，建立miRNA过表达的模型；而miRNA inhibitor是可以与miR-21完全互补的反义寡核苷酸序列，转染后可抑制miRNA的功能[15]。miRNA在卵巢癌的发生发展中存在直接调控作用，研究显示卵巢癌组织中有35个miRNA的表达与正常对照标本相比有统计学差异，其中31个miRNA呈现低表达[16]。本研究显示过表达miR-21能抑制卵巢癌干细胞的增殖活性，增加细胞的凋亡。

miRNAs在肿瘤中的表达往往是失调的，与其他肿瘤相似。鼻咽癌鳞状肿瘤也有其特异的miRNA表达谱，miRNAs可通过靶向作用于多种肿瘤抑制基因或转移抑制基因，调节卵巢癌干细胞的生长、侵袭和转移[17]。卵巢癌的主要致病基因尚不清楚，而对卵巢癌相关基因定位，或寻找突变位点对卵巢癌发病机制起重要作用，有利于鼻咽癌的早期诊断[18]。有研究显示卵巢癌中cdc4蛋白的表达显著低于癌旁组织及正常组织，cdc4蛋白的表达与卵巢癌患者的性别、年龄、肿瘤部位无关，而与肿瘤浸润深度、分化程度、临床分期、淋巴结转移有关，可成为早期诊断、判断卵巢癌预后及浸润转移的生物学指标[19-20]。本研究显示转染细胞48 h后，mimic组的G0/G1期细胞数目显著高于blank组与mimic NC组，S、G2/M期细胞数目显著减少(P<0.05)。表明miR-21可使大部分细胞分裂处于G0/G1期，但是在此过程中还有哪些原癌基因和抑癌基因的参与，还需要深入研究。

cdc4是控制细胞周期进入M期的关键因子之一，其表达量的变化与肿瘤的发生机制有关，已被发现是1种新的肿瘤相关抗原[21]。cdc4能促使cyclin E、c-Myc、c-Jun等癌基因蛋白类的降解，可成为肿瘤生物治疗的新靶点[22]。miRNAs可通过与靶基因mRNA的特异性结合来降解mRNA或抑制蛋白的翻译，miRNAs除参与肿瘤癌细胞的分化外，还在肿瘤细胞的侵袭和迁移过程过程中发挥重要作用[23]。本研究显示转染miR-21到卵巢癌干细胞48 h后，cdc4蛋白的表达量显著降低。相关研究也显示cdc4对肿瘤的发生起促进作用，很多肿瘤中存在cdc4的高表达，抑制cdc4表达可以起到抑癌作用[24]。不过本研究也有一定的缺陷，首先是研究样本数目较少，其次虽然明确miR-21能抑制细胞增殖与促进细胞凋亡，但是其是否为卵巢癌的抑癌基因还有待深入分析。

综上所述，过表达miR-21能抑制卵巢癌干细胞的增殖与促进细胞凋亡，调节细胞周期，其具体机制可能是miR-21通过负调控cdc4的表达而实现。