雌、孕激素对宫颈腺癌Hela细胞荷瘤裸鼠的影响

涂开家 陈 偲 罗 美 李明梅 程晓晓 李隆玉

宫颈癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一，据 WHO癌症研究署估计，全球每年新发病例49.32 万，中国约 13.15万(28.88%)。近年来，由于宫颈癌的筛查广泛开展，宫颈鳞癌发病率有了明显的下降，但宫颈腺癌的发病率却逐年增加，约占宫颈癌总数的 20%[1]，其中约 60.3%的宫颈腺癌患者年龄小于 50 岁，而小于 40 岁的患者约57.38%[2]。

激素替代治疗 (hormone replacement therapy,HRT)可极大改善围绝经期雌激素缺乏综合征[3-4]，能明显提高患者生活质量。但由于女性生殖器官为激素的靶器官，众多学者认为雌激素会促进宫颈癌的发展[5-6]，但也有学者提出不同观点，认为雌激素能抑制宫颈腺癌细胞的增殖和分化[7]，孕酮对乳腺癌有促进作用，但却可以减少和抑制子宫内膜癌的发生发展[8]，孕酮还可以减少卵巢癌的发生[9]，因此，有理由认为，宫颈作为孕激素的靶器官[10]，孕激素可能对宫颈病变甚至宫颈癌的发生发展有着重要的影响。Rour等[11]2016年的一项大样本前瞻性队列研究，发现围绝经或绝经后妇女使用外源性激素替代治疗的患者宫颈癌的发病风险更低，且激素替代治疗持续时间越长的妇女宫颈癌发病风险越低(≤1年、2～4年及≥5年的HR分别是0.7、0.6及0.4)，同时，相比于单纯的雌激素替代治疗，研究组更推荐雌孕激素联合替代治疗，但研究未探讨病理类型相关风险。

相对于宫颈鳞，宫颈腺癌患者治疗后的激素替代治疗的争议更大，为此，我们用宫颈腺癌Hela细胞悬液接种裸鼠，建立荷瘤裸鼠模型，用E2(雌二醇)、P(醋酸甲羟孕酮)及E2+P对裸鼠进行分组治疗，观察肿瘤大小及裸鼠体重及生存时间的差异，初步评价激素干预对荷瘤裸鼠体内Hela细胞肿瘤生长的影响，为临床进行宫颈腺癌激素替代治疗提供基础实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验细胞株及动物

宫颈腺癌Hela细胞购自中国科学院上海细胞资源中心，BLAB/c雌性裸鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。

1.2 实验方法

采用免疫组化方法检测体外培养的人宫颈腺癌HeLa细胞雌、孕激素受体的表达；

实验分四组：E2(雌二醇)组、P(醋酸甲羟孕酮)组、E2+P组及对照组，32只4周龄裸鼠随机分配，各组8只(用剪趾法标记)，分别于裸鼠双侧后肢背部皮下注射Hela细胞悬混液(0.1 ml细胞悬液约5×106个细胞)，其中E2中8号裸鼠组右侧背部接种失败，E2组只接种成功15个部位，余各均接种16个部位，细胞悬液注射后24 h分别予E2(1 μg)、P(150 μg)和E2+P(1 μg+150 μg)及实验组等体积溶剂(1%DMSO+10%羟丙基-β环糊精的生理盐水100 μl)腹腔注射治疗。

每天观察各组老鼠的生活状态，种瘤当天、给药当天和给药后每3天称重，共计给药1个月。给药期间观察各组肿瘤形成及生长情况。

每只裸鼠腹腔注射5%水合氯醛1 ml麻醉，后用颈椎脱臼法处死裸鼠，分离取出肿瘤，测量分离出来的肿瘤长径、短径并称重。体积(mm3)=(长径×短径×2)/2。抑瘤率=(空白组-实验组)/空白组×100%。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 细胞株的一般特性

Hela细胞为贴壁生长细胞，呈梭形，约2～3天传代一次。

2.2 Hela细胞雌、孕激素受体Er、Pr检测

Hela细胞Er表达结果显示，与阳性对照乳腺癌MCF7类似，Hela细胞雌激素受体为强阳性(+++)。

Hela细胞Pr表达结果显示，与阳性对照乳腺癌MCF7类似，Hela细胞孕激素受体为强阳性(+++)，证实所购得的Hela细胞符合实验要求，进一步进行后续实验。

2.3 荷瘤裸鼠的建立及激素治疗

细胞悬液注射一周后裸鼠肿瘤细胞接种部位出现不活动的硬结，直径约5～8 mm左右，脱臼法处死小鼠取瘤送病理检查，提示成功建立Hela细胞荷瘤裸鼠模型，对照组、E2组、P组及E2+P组各组成瘤率分别是：87.5%(14/16)、100%(15/15)、81.25%(13/16)、100%(16/16)，各组间成瘤率无明显差异(P>0.05)。肿瘤接种后两周，各组间裸鼠体重相比差异无统计学意义(P>0.05)；各组肿瘤体积相比，E2组与对照组相比肿瘤体积较大，差异有统计学意义(P<0.05)，肿瘤促进率达到47.89%，E2组体积较P组更大，差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。

表1 接种两周各组间小鼠体重、成瘤率、肿瘤体积及肿瘤促进率

注：#为E2组肿瘤体积与对照组相比，P<0.05；△为E2组与P组肿瘤体积相比，P<0.05；*为各组间成瘤率相比，P>0.05；▲为各组裸鼠体重相比，P>0.05。

实验裸鼠用药82天，对照组、E2组、P组及E2+P组的肿瘤体积分别是105.89 mm3、450.17 mm3、107.96 mm3及168.94 mm3，其中E2与对照组相比，肿瘤体积更大，有统计学意义(P<0.05)，各组裸鼠体重之间差异无统计学意义(P>0.05)，我们观察到，肿瘤体积最大者出自E2组，E2组的1号鼠(E2-1)有腹腔转移瘤(体重19.5 g)，存活、E2+P组的2号(E2+P-2)和7号鼠(E2+P-7)分别有头部转移及腹腔转移瘤(二者体重分别为15 g及9.9 g)，并且均死亡，转移率分别为12.5%(1/8)及25%(2/8)，其中E2组的转移瘤体积为171.5 mm3，E2+P的转移瘤体积分别为1070 mm3和600 mm3，E2+P转移瘤体积明显更大(表2)。

表2 接种82天各组间小鼠体重、肿瘤体积及转移瘤情况

注：*为小鼠体重各组两两对比差异无统计学意义；#为因肿瘤体积不符合正态性检验，用秩和检验对各组进行两两比较，发现P组、E2+P组分别与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，E2组与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，E2与P组相比，差异亦有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

目前大多数观点认为宫颈鳞状细胞癌与雌激素无关，可以行激素替代治疗，但宫颈腺癌的激素替代治疗仍存在较多争议，有学者认为一定浓度的E2(0.5～10 nmol/l)能促进宫颈腺癌Hela细胞的增殖[12]，随着E2浓度的增加(1 nmol/l)，促进作用增强[13]，Wren 等[14]提出，对于宫颈腺癌患者 HRT被认为是1种潜在的致癌促进剂，要慎用；而另外一些学者的研究观察到不同的结果，认为一定浓度的E2(20～120 nmol/l)能抑制Hela细胞的增殖，并使细胞周期抑制在G2/M期，并进一步促进其凋亡[7]。

在本实验中，Hela细胞接种裸鼠后24 h即开始每天给裸鼠腹腔注射E2、P、E2+P，Hela细胞接种1周后经病理证实荷瘤裸鼠构建成功，各组成瘤率统计学无差异(P>0.05)，用药2周，各组裸鼠体重统计学无差异(P>0.05)，E2组肿瘤与对照组及P组相比肿瘤体积较大(P<0.05)，E2组肿瘤促进率达到47.89%，肿瘤接种82天，实验裸鼠中E2组的肿瘤体积与其他组相比更大(P<0.05)，且肿瘤最大者出自E2组，并有1只裸鼠出现腹腔转移瘤，我们认为E2能促进肿瘤进展，这与其他作者报道的相似[6,15]。

关于孕激素对宫颈癌的作用，Harris等[16]对458位致瘤性HPV感染的妇女的研究发现，连续使用孕激素(MPA)2年并不增加发生宫颈病变的风险，且观察到MPA与CIN以上病变成负相关，Yoo等[15]基于HPV E6、E7基因转基因小鼠模型的研究发现，孕酮能抑制甚至消除因E2所致的孕激素受体阳性的小鼠下生殖道肿瘤，而对孕激素受体阴性的小鼠没有这种作用，认为孕激素对宫颈病变的抑制作用。我们观察到，E2+P组2只裸鼠分别有头部及腹腔转移瘤，并且均体重较轻(二者体重分别为15 g及9.9 g)，明显低于各组平均体重[对照组、E2组、P组、E2+P组分别是(21.23±1.04)g、(21.0±0.6)g、(20.76±3.61)g、(21.21±1.91)g]，两只裸鼠均于81天死亡，且E2+P组转移瘤体积明显较E2更大，考虑E2+P可能促进早期肿瘤转移，导致恶液质从而进一步导致其死亡，暂未见类似报道。但因本研究观察时间欠缺，药物浓度单一，下一步有待进一步延长实验时间、增加激素剂量梯度进一步观察，从而为进一步的机制研究奠定基础。

性激素对宫颈腺癌的影响相关因素较多，包括激素浓度、作用时间，给药方法等，但随着人们的不断探索，相信未来能对其作用机制有进一步的了解。