盐分胁迫对烤烟叶片亚细胞结构及生理生化指标的影响

马静，王静，姚鹏伟，叶红潮，余海涛，王鹏，李玉宝，叶协锋*

1 河南农业大学烟草学院，国家烟草栽培生理生化研究基地，烟草行业烟草栽培重点实验室，郑州 450002；2 洛阳市烟草公司，洛阳 471000；3 湖南中烟工业有限责任公司，长沙 410000；4 湖北中烟工业有限责任公司，武汉 430000

我国盐渍化土壤面积约3600万hm2，占全国可利用土地面积的4.88%[1]，主要分布在东北、西北和华北地区。近年来，由于农药的滥用及灌溉、施肥方式的不合理，造成土壤盐渍化越来越普遍，严重影响了农作物的生长发育[2]。研究表明植物叶片细胞的内部结构与其耐盐性密切相关[3-4]，尤其是叶肉细胞中叶绿体、细胞核、线粒体等细胞器的形态结构对外界环境变化较敏感。目前，相关研究主要集中在小麦、水稻等以采收籽粒为主的作物上[5]，对烤烟等以采收叶片为主的作物研究较少。

植物在长期的进化过程中，获得了通过提高活性氧清除酶的活性来应对逆境的机制，从而保证作物的正常生长发育[6]。超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、过氧化物酶（Peroxidase，POD）和过氧化氢酶（Catalase，CAT）是生物膜保护酶系统的重要成员。在逆境条件下，它们协同作用，从而减轻活性氧自由基对膜系统的伤害，抑制膜脂的过氧化[7-8]。其中，SOD能催化体内的歧化反应，将超氧自由基转化为O2和H2O2，而CAT和POD则负责清除SOD分解产生的H2O2，使其分解成没有毒害的H2O和O2[9]。丙二醛（Malondialdehyde，MDA）是自由基作用于脂膜发生氧化反应的产物[10]，在一定程度上能反应植物细胞膜结构受氧化的破坏程度[11]。Apel[12]等的研究表明，当植株受到盐胁迫后，会诱导植株体内活性氧增多，造成细胞膜脂过氧化，从而影响植物正常生长。朱玉鹏[13]等研究发现，在一定盐分浓度范围内，冬小麦的SOD、POD活性增强，MDA含量会随盐浓度的增加而增加。随着盐浓度的升高，木薯幼苗[14]中的SOD、POD的活性先增强后减弱，CAT活性先下降后上升。

目前，植物盐胁迫研究中大都采用NaCl或Na2SO4[15-16]，而对多种盐混合胁迫或者不同盐分胁迫对比研究未见报道。有研究表明，植物吸收过多的SO42-会引起植物缺钙，使植物叶片发黄、从叶柄处脱落；吸收过多的Cl-会使植株生长停滞、叶片黄化，叶缘似烧伤状[17]。对于烤烟来说，吸收过多硫，会使烟叶燃烧性下降，在燃烧过程中会出现恶臭味；过多的Cl-会使叶片淀粉含量增多，叶片肥厚而脆，叶面光滑，颜色不均匀[18]。本研究选取NaCl和Na2SO4两种盐来模拟盐胁迫环境，比较烤烟在不同浓度的两种盐处理条件下，叶片抗氧化酶活性的变化以及叶绿体、线粒体和细胞核等叶肉细胞超微结构的变化特点，从解剖学角度探究两种盐对烤烟叶肉细胞超微结构影响的差异，并结合抗氧化酶等生理指标，探讨烤烟叶肉细胞对NaCl和Na2SO4的不同反馈机制以及烤烟盐胁迫伤害的生理响应规律，以期为烤烟的耐盐机制研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验于2018年8月在河南农业大学实验室内进行，供试品种为中烟100。首先用Hoagland营养液在蛭石中培育烟苗，待长至四叶一心时（苗龄为40 d），选取无病虫害且长势一致的健壮烟苗，分别添加100 mmol/L、200 mmol/L、400 mmol/LNaCl的 Hoagland溶液和50 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/LNa2SO4的Hoagland溶液作为处理[5,19-20]，对照组为正常Hoagland营养液，每组5株，3次重复。

1.2 测定项目与方法

电镜制样及观察测量：在处理3 d后，从下往上数第3片叶作为电镜观察材料。在叶片中部，避开主脉附近切下2 mm×2 mm左右的叶片，在0.1 mmol/L磷酸缓冲液（pH7.2）配制的2.5%戊二醛溶液中在0～4℃下固定24 h以上，之后用磷酸缓冲液清洗3次，各30 min；再用1%的锇酸固定2 h，然后用磷酸缓冲液清洗并用梯度酒精（30%、50%、70%、90%各15 min，100%酒精2次各30 min）脱水，再用100%丙酮置换，之后用环氧树脂812包埋（树脂组织处理器 LEICA EM TP），用超薄切片机（LEICA EM UC7）切片后用饱和醋酸双氧铀水溶液染色，再用柠檬酸铅溶液染色后用透射电子显微镜（JEM-1400，日本）观察拍照。

在处理3 d后，从下往 取第3片叶中称取0.1 g样品加入1 mL 150 mmol/L，pH7.0的磷酸缓冲液，冰浴上研磨，8000 g、4℃离心10 min，上清液部分为酶粗提取液，用于 MDA、SOD、POD和CAT的测定。MDA、SOD、POD和CAT的测定均按照MDA、SOD、POD和CAT试剂盒（苏州科铭，苏州，中国）中说明书的方法操作。

2 结果与分析

2.1 NaCl和Na2SO4对烤烟叶肉细胞叶绿体超微结构的影响

正常的烤烟叶肉细胞中的叶绿体都紧贴细胞壁，长轴与细胞壁平行，呈梭型或椭圆形，且各细胞器结构清晰可见（图1A）。用100 mmol/LNaCl处理后如图1B所示：叶绿体排列有序，紧贴细胞壁，仍具有完整的结构，但淀粉粒较CK有所减少。中等浓度（200 mmol/L）NaCl处理后，叶绿体与细胞壁之间出现间隙，且叶绿体中的嗜锇颗粒含量有所增多，同时基粒片层结构模糊，并出现断裂现象。叶绿体背膜部分边缘模糊（图1C）。当NaCl浓度达到400 mmol/L时，叶绿体缩小，结构松散，背膜解体，失去完整性，与细胞质间不再有明显的界限。叶绿体中的质体小球进一步增多，基粒片层松散、变形，部分基粒解体消失（图1D）。

在50 mmol/LNa2SO4处理后，烤烟叶绿体结构仍呈梭型，形态饱满，基粒片层排列整齐、有序，类囊体片层垛叠整齐，膜系统结构完整，且脂质球的数目和大小没有明显的变化，但与100 mmol/LNaCl处理相比，叶绿体中的淀粉粒含量较多（图1E）。当Na2SO4处理浓度增高到100 mmol/L时，有部分叶绿体悬浮于细胞质中，但大部分仍紧贴细胞壁。此时叶绿体结构变长，并有断裂现象，类囊体结构解体，与对照相比出现了更多的嗜锇颗粒。基粒片层松散、变形，有断裂的现象，垛叠之间出现明显空隙，密度降低，膜边缘模糊，同时叶绿体中的淀粉粒数量减少（图1F）。当Na2SO4浓度达到200 mmol/L时，叶绿体由梭形进一步肿胀变为球形，失去自身的完整结构，内部的类囊体消失，破损的叶绿体充斥在细胞质中；嗜锇颗粒明显增多，叶绿体中鲜见淀粉粒（图1G）。

图1 NaCl和Na2SO4对烤烟叶肉细胞叶绿体结构的影响Fig.1 Influence of NaCl and Na2SO4 on the chloroplast structure of mesophyllcells of tobacco leaves

2.2 NaCl和Na2SO4对烤烟叶肉细胞线粒体结构的影响

由图2A可知，未添加盐溶液的烤烟叶肉细胞中，线粒体结构饱满，基质丰富，双层膜结构完整，可观察到内膜凹陷形成的嵴。当100 mmol/LNaCl处理3天后，线粒体结构与对照无明显差别（图2B）。当NaCl浓度为200 mmol/L时，外膜结构完整，部分线粒体呈扁球形，但与对照相比嵴的数量减少，内膜系统可观察到较多的嗜锇颗粒，线粒体内部出现空泡（图2C）。当NaCl浓度为400 mmol/L时，线粒体大部分内膜结构已经破坏，无结构清晰的嵴，内部绝大部分为空泡，出现少数外膜破裂的现象（图2D）。

图2 NaCl和Na2SO4对烤烟叶肉细胞线粒体结构的影响Fig.2 Influence of NaCl and Na2SO4 on mitochondrial structure of mesophyllcells of tobacco leaves

50 mmol/L Na2SO4和100 mmol/L Na2SO4处理后，与对照无明显差别，线粒体结构完整且形态饱满，可明显观察到内膜凹陷（图2E、F）。当Na2SO4浓度达到200 mmol/L时，线粒体基质密度明显降低，内膜几乎完全溶解，且大部分线粒体结构瓦解（图2G）。

图3 NaCl和Na2SO4对烤烟叶肉细胞细胞核结构的影响Fig.3 Influence of NaCl and Na2SO4 on the nuclear structure of mesophyll cells of tobacco leaves

2.3 NaCl和Na2SO4对烤烟叶肉细胞细胞核结构的影响

对照组烤烟叶肉细胞的细胞核膜结构完整，双层膜结构清晰可见，核仁呈圆形，结构完整，核中染色质分布均匀（图3A）。在用100 mmol/LNaCl处理后，细胞核双层膜结构清晰，核仁结构完整，但核仁边缘略有模糊，核中染色质均匀分布（图3B）。200 mmol/LNaCl处理后，细胞核虽能观察到核膜双层结构，但略有凹凸，核仁密度变小，且膜结构损坏，核中染色质分布不均（图3C）。NaCl浓度升高至400 mmol/L时，核膜解体，核中的染色质高度凝缩，细胞核边缘模糊不清，部分细胞核核膜解体，核质外溢，核仁消失（图3D）。

50 mmol/L Na2SO4处理的叶片组织与对照相比细胞核结构无明显变化（图3E）。100 mmol/L Na2SO4处理下细胞核核膜结构完整，平滑，染色质分布均匀，但核仁边缘略有模糊（图3F）。200 mmol/L Na2SO4处理下大部分细胞核萎缩、破裂解体（图3G）。

2.4 NaCl和Na2SO4对烤烟叶肉细胞细胞壁的影响

对不同浓度盐分胁迫下烤烟叶肉细胞细胞壁的透射电镜照片观察发现，对照的细胞壁表面光滑，结构完整，与细胞膜紧密贴合。在低浓度NaCl和Na2SO4条件下，叶肉细胞细胞壁厚度减小（图4）。200 mmol/LNaCl处理条件下，烤烟叶肉细胞细胞壁膨胀，细胞膜间隙增大。随着NaCl浓度的升高，细胞壁表面凹凸不平，且边缘模糊，细胞厚度有所减小。在100 mmol/LNa2SO4处理条件下，细胞壁厚度与对照相比无明显变化。200 mmol/L Na2SO4处理条件下，细胞壁厚度降低。

图4 NaCl和Na2SO4对烤烟叶肉细胞细胞壁的影响Fig.4 Influence of NaCl and Na2SO4 on the cell wall of mesophyll cells of tobacco leaves

2.5 NaCl和Na2SO4对烤烟叶片含水率的影响

从图5可以看出，对照组的叶片含水率为95.00%，不同浓度NaCl处理后的含水率分别为94.13%、91.86%和83.47%；Na2SO4处理的含水率分别为94.65%、91.80%和89.58%。其中，低浓度NaCl和Na2SO4对烤烟叶片含水率影响不大，随盐分浓度升高，烤烟叶片含水率逐渐下降，在Na+浓度一致条件下，高浓度（400 mmol/L）NaCl处理下烤烟叶片含水率与对照相比差异最显著。低浓度NaCl和Na2SO4处理对烤烟叶片含水率影响不大，但随着盐分浓度的升高，烤烟叶片含水率逐渐下降。

图5 NaCl和Na2SO4对烤烟叶片含水率的影响Fig.5 Influence of NaCl and Na2SO4 on moisture content of tobacco leaves

2.6 NaCl和Na2SO4对烤烟叶片抗氧化系统的影响

从图6可以看出，添加NaCl和Na2SO4溶液的烟草叶片中MDA含量、SOD、POD和CAT酶活变化趋势相同。MDA含量、SOD和POD活性随着盐浓度的升高均呈现出先增加后减少的趋势，而CAT活性是逐渐增强，且NaCl溶液处理的叶片比Na2SO4处理的MDA含量、SOD、POD和CAT活性的变化幅度更大，与对照相比差异更显著。表明在Na+浓度相同条件下，NaCl对烤烟叶片氧化平衡影响较大，同时对细胞膜破坏程度也大。

3 讨论

当植物受到盐胁迫时，叶片组织中各细胞器容易遭到破坏，而叶绿体是对盐分最敏感的细胞器[21-24]。在本研究中，正常培养的烟草叶片叶绿体结构完整，淀粉粒分布均匀，基粒片层清晰。在NaCl处理条件下，随着NaCl浓度升高，叶绿体由饱满的椭圆形逐渐变长，膜结构解体。Na2SO4处理条件下，随着盐浓度增加，叶绿体结构会逐渐膨胀，变成圆形，相比NaCl处理，Na2SO4对叶绿体膜结构的影响较小，且低浓度Na2SO4对叶绿体中的淀粉粒几乎没有影响。然而有研究指出，在野大麦[20]叶肉细胞中，随NaCl浓度升高，叶绿体中的淀粉粒含量增多，这与本试验研究结果相反，这可能是由于烤烟叶片和野大麦叶片的结构差异较大，对盐分的响应不同。

线粒体是细胞能量的供给者，曾经被认为是对胁迫不敏感的细胞器[25-26]。但在本研究中，随NaCl和Na2SO4浓度的升高，线粒体的结构都发生明显变化，在NaCl处理条件下，线粒体内部间隙逐渐增大，膜结构破坏严重。在Na2SO4处理条件下，线粒体内嵴减少，膜结构也相对完整。对于烤烟叶肉细胞细胞核来说，NaCl处理会造成细胞核内核质分布不均匀，当NaCl浓度达到400 mmol/L时，细胞核的双层膜结构遭到破坏，但当Na2SO4与NaCl处理中Na+浓度一致时，即达到200 mmol/L时，叶片中细胞核双层膜结构依然完整。由此可以推测，随NaCl浓度升高，可能会抑制烤烟叶片伸展，导致叶色发黄，且在Na+浓度一致的条件下，NaCl与Na2SO4相比抑制作用更明显。

研究表明，盐胁迫会引起植物细胞中活性氧自由基的产生及其清除系统的破坏，而细胞质膜破坏会积累较多的MDA，MDA的积累量也在一定程度上反映了耐盐能力的强弱[27]。SOD、POD和CAT是植物应对逆境的重要的抗氧化酶，它们主要通过清除超氧阴离子自由基、过氧化氢和羟自由基来降低活性氧对细胞膜的伤害和减轻膜质过氧化[28-30]。本试验中，在低浓度和中等浓度NaCl和Na2SO4条件下，SOD、POD、CAT活性增强，MDA积累量增多，这可能是由于在盐的作用下，烤烟叶片中活性氧自由基、过氧化氢等积累量升高，促使烤烟产生相应的生理反应，使抗氧化酶活性增强。随着NaCl和Na2SO4浓度进一步升高，SOD、POD活性降低，说明此时活性氧的积累量超出抗氧化酶可清除的范围，叶片细胞受损严重。当Na+浓度一致时，NaCl处理的烤烟叶片内积累的MDA更多，SOD、POD、CAT活性变化也更显著，这也从生理水平上反映出在NaCl处理下，烤烟叶肉细胞膜受伤害程度较深，表明与Na2SO4相比NaCl处理会使烤烟叶肉细胞产生更多的活性氧，对细胞质膜结构的破坏更强。

Na+和Cl-是对植物影响较大的盐分离子，所以在盐胁迫的研究中，如何避免Na+和Cl-毒害是当前亟需解决的问题[31]。本研究利用不同浓度的Na2SO4和NaCl对烤烟进行胁迫处理，从研究结果可以看出，NaCl对烤烟叶肉细胞的影响比Na2SO4要大，这与大多数的研究一致，均认为NaCl是主要的盐害类型。杨春武[32]等人认为，阳离子对植物适应盐渍环境具有重要意义，但阴离子也是维持细胞环境和细胞代谢过程的必要条件，所以不同的阴、阳离子类型对植物的作用机制不同，在本试验中，虽然阳离子相同，且浓度一致，但由于阴离子的不同，对烤烟产生的胁迫程度有明显的不同，包括对叶绿体、线粒体、细胞核等结构的影响均有所差异，所以对植物造成的盐伤害与离子类型的关系，还需要进一步深入研究。

4 结论

当NaCl浓度为100 mmol/L时，叶绿体中的淀粉粒减少； NaCl浓度达到200 mmol/L时，对烤烟叶肉细胞亚细胞结构、叶肉细胞细胞壁厚度及抗氧化酶等产生显著影响。当Na2SO4浓度为200 mmol/L时，对烤烟叶肉细胞亚细胞结构的影响显著。在Na+浓度一致的条件下，NaCl对烤烟叶肉细胞的影响明显高于Na2SO4，主要表现在对叶片细胞膜结构的破坏程度大，且NaCl对烤烟叶片抗氧化酶平衡系统的影响更大。