闽西地区猪流行性腹泻病毒N基因分子进化及序列分析

董波 李静楠 曹雪珍

摘要：分析闽西地区猪流行性腹泻病毒（PEDV）N基因的遗传进化特征，收集闽西地区猪流性腹泻病例组织样品8份，用逆转录PCR（RT-PCR）扩增N基因，连接至pMD-18T载体进行测序，并与国内外已知参考毒株序列进行比对及遗传进化分析。结果显示，8株闽西流行毒株之间N基因核苷酸的同源性为9.8%～100.0%，推导的氨基酸序列的同源性为99.5%～100.0%，而闽西毒株与早期疫苗毒株CV777和SM98的同源性较远。氨基酸序列分析表明，闽西毒株氨基酸序列存在15处突变，与2010年后中国流行毒株变异位点相同。提示闽西地区毒株为目前国内流行毒株，与疫苗毒株亲缘关系较远，可能导致机体针对疫苗毒株产生的抗体不能够有效抵抗变异毒株，不能给猪群提供很好的免疫保护，因此需要基于变异毒株研究出有针对性的疫苗来预防PEDV。

关键词：猪流行性腹泻病毒;N基因;遗传分析

中图分类号： S852.65+1  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）17-0059-04

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，简称PED）是由猪流行性腹泻病毒引起的一种高度接触性传染病，以腹泻、呕吐为主要临床特征，冬、春季多发[1]。该病在世界大多数国家均有报道，尤其对韩国、中国、日本、菲律宾、泰国等亚洲国家造成了严重经济损失，引起养猪业的广泛关注[2]。2010年末，我国暴发的PED影响了河北、安徽、广西、广东、浙江、江西、四川、湖南、福建等省份的养猪业[3]。此次疫情造成的损失惨重，甚至之前接种过猪流行性腹泻病毒（PEDV）疫苗的猪群也同样发病，究其原因，可能是由于流行毒株变异或者毒力增强，使现有疫苗难以提供免疫保护[4]。

猪流行性腹泻病毒为冠状病毒科冠状病毒属成员，为单股正链RNA病毒，编码2个复制酶多聚蛋白ppla和pplab，1个非结构蛋白ORF3和4个结构蛋白纤突蛋白（spike，简称S）、膜蛋白（membrane，简称M）、核衣壳蛋白（nucleocapsid，简称N）和小膜蛋白（small membrane，简称E）[5]。其中，N蛋白由1 326个核苷酸组成，编码442个氨基酸。N蛋白是一种多功能磷酸化蛋白质，能够与细胞膜和磷脂结合，改变宿主细胞的转录，促使RNA复制体的形成和病毒组装[6]。N基因在诱导免疫和病毒感染的致病机制中起重要作用，N蛋白的表达可抑制细胞RNA和蛋白质G2/M期的合成从而促进病毒的繁殖[7]。在早期感染PEDV时，宿主体内就能产生抗N蛋白高水平的抗体，因此N蛋白可作为早期检测发病猪是否感染PEDV的免疫靶细胞[8]。

近年来，PEDV的流行趋势不断增长，给养猪业造成严重的影响。因此，对PEDV的遗传变异情况进行监测是防控的重要环节。本研究收集闽西地区PEDV流行毒株，利用逆转录PCR（RT-PCR）扩增N基因，将PEDV N基因序列进行同源性比较，绘制系统发育进化树，理清闽西地区PEDV与国内外流行毒株以及疫苗毒株之间的遗传进化关系，为做好PEDV的防控提供资料参考。

1 材料与方法

1.1 样品

样品选取2013年1月至2016年12月闽西地区规模化养猪场的PEDV阳性样品8份。1.2 主要試剂

AxyPrep总RNA小量制备试剂盒、AxyPrep质粒DNA小量试剂盒、AxyPrep凝胶回收试剂盒，购自康宁生命科学（吴江）有限公司;dNTP、反转录酶M-MLV、5×M-MLV buffer、pMD18-T Vector，购自宝生物工程（大连）有限公司;DL2000 DNA marker、10×loading buffer，购自广州瑞真生物技术有限公司;Oligo（dT）18、Murine RNase Inhibitor、T4 DNA Ligase、10×Ligase Buffer，购自南京诺唯赞生物科技有限公司;胰蛋白酶（tryptone）、酵母（yeast extract），购自OXOID公司;Ampicillin（氨苄西林）（100mg/mL）、NaCl、琼脂粉，购自Biowest公司;异丙醇、三羟基甲基氨基甲烷（Tris碱）、溴化乙锭（EB）、三氯甲烷、乙二胺四乙酸（EDTA）、乙醇、十二烷基硫酸钠（SDS）、DEPC（焦碳酸二乙酯）水，购自广东省汕头市西陇化工股份有限公司。

1.3 提取病毒总RNA及逆转录

按照试剂盒提供的操作手册，从试验猪小肠组织及内容物中提取总RNA。取洁净EP管，加入RNA 11 μL、Oligo（dT）18 1 μL，12 000 r/min离心40 s，于70 ℃水浴10 min，加入 5×M-MLV Buffer 5 μL、M-MLV 1 μL、dNTP 1 μL、DEPC水6 μL，混匀后，42 ℃水浴30 min，95 ℃ 水浴10 min。cDNA于 -80 ℃ 下保存。

1.4 E基因的扩增

参考GenBank上已发表的PEDV毒株N基因序列，使用Premier Premier 5.0生物软件设计合成1对特异性引物，PEDV-N-F：GGATCCATGGCTTCTGTCAGCTTTC;PEDV-N-R：CTCGAGTTTCAACGGCCGTATCACC。以cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应程序如下：95 ℃预变性5 min;94 ℃ 变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环;72 ℃延伸10 min。使用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，观察并记录结果。

1.5 重组质粒的构建和鉴定

采用AxyPrep凝胶回收试剂盒回收PCR产物，将纯化产物与pMD18-T Vector连接，16 ℃水浴4 h。将10 μL连接产物转化入DH5α感受态细胞，37 ℃培养过夜。提取质粒，进行鉴定。将阳性质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.6 序列分析

8株闽西毒株分别命名为LY201301、LY201302、LY201401、LY201402、LY201501、LY201502、LY201601和LY201602。采用表1中标准毒株的基因库登录号，获取参考毒株N基因序列。通过DNAstar和MEGA 5.2分子生物学分析软件对8株闽西地区的PEDV N基因序列与国内外已发表的毒株进行同源性分析，绘制PEDV基因系统遗传进化树。

2 结果与分析

2.1 N基因的扩增、纯化、克隆及测序

采用RT-PCR技术，对8份样品的N基因进行扩增，产物经凝胶电泳鉴定，由图1可知，获得大小约为1 326 bp的基因片段。将纯化后的PCR产物连接到pMD18-T载体上，送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，序列结果正确。

2.2 N基因的序列比对及同源性分析

闽西毒株N基因核苷酸序列之间的同源性为99.8%～100.0%，与26株引用毒株之间的同源性为94.3%～99.8%。闽西毒株与2010年以后中国分离毒株的同源性均在99%以上，与2013年美国毒株的同源性也均在99%以上。由图2可知，经遗传进化分析，34株毒株可分成3大组，Ⅰ组包括疫苗株CV777、2株韩国毒株（Attenuated DR13和SM98）及6株早期中国毒株;Ⅲ组包括2013年分离的4株美国毒株、1株韩国毒株、2010年后分离的中国流行毒株以及8株闽西毒株。系统发育分析显示，闽西毒株与经典毒株CV777、2010年前中国分离毒株以及韩国毒株（Attenuated DR13和SM98）的亲缘性较远，与2010年以后中国分离毒株的亲缘性较高，与2013年美国毒株的亲缘性也较高，说明闽西毒株与目前国内以及美国流行毒株可能来自同一祖先。

2.3 N基因的氨基酸结构特征

由表2的序列比对结果可知，N基因全长为1 326 bp，编码442个氨基酸，包含1个完整的阅读框架。闽西毒株与疫苗毒株CV777相比，氨基酸序列仅存在15处突变。这些突变位置与2010年后的中国变异毒株一致。

3 讨论

在PEDV的RNA合成过程中，N蛋白能与细胞膜磷脂结合，促进病毒的组装和RNA复制体的形成[9]。另外，在PEDV的结构蛋白中，N蛋白所占比例最大，它能在感染的细胞中大量表达，并且在感染初期，动物体内就能产生较高水平的抗N蛋白的抗体[10]。N蛋白具有高度保守的特性，可以作为早期诊断的靶蛋白，可利用N蛋白建立PEDV的分子生物学诊断技术[11]。因此，选择N基因进行PEDV遗传进化分析，有助于了解病毒的流行趋势与进化规律，对于病毒的防控和疫苗的研制具有重要意义[12]。本研究收集8株闽西毒株，利用PCR扩增获得8株病毒N基因，使用生物信息学软件进行系统发育分析，有助于从分子水平阐明闽西PEDV毒株与国内外毒株的亲缘关系。

同源性分析结果显示，闽西毒株之间的核苷酸同源性为 99.8%～100.0%，与2010年后中国分离毒株的进化关系较近，说明闽西毒株与目前国内流行毒株具有很高的同源性。然而，闽西PEDV流行毒株与疫苗毒株CV777的核苷酸同源性为94.0%～95.4%，遗传进化关系较远，提示以CV777为免疫原设计的疫苗，在防治PED方面可能作用不显著，成为控制PEDV暴发的主要隐患。另外，闽西毒株与2013年美国流行毒株的同源性较高，亲缘性较近，均属于Ⅲ组，说明闽西流行毒株与2010年后中国分离毒株以及2013年后美国分离毒株可能来自同一祖先。并且由遗传进化树可见，早期韩国毒株（virulent DR13）也处于Ⅲ组，提示该毒株和目前国内外流行毒株存在着潜在关系，需要进一步分析。8株闽西毒株N基因无特有的片段缺失和插入，存在15处相同突变，这些突变位点与2010年后中国分离毒株的突变位点一致，进一步证实了闽西毒株属于2010年后中国流行毒株，也表明N基因相对保守，在目前国内的流行毒株中基本没有出现变异。

总之，本研究结果证实闽西PEDV毒株属于目前国内外的流行毒株，与疫苗毒株（CV777）的进化关系较远，可能导致由CV777设计的疫苗对当前流行毒株的保护力不够，不能给猪群提供很好的免疫保护，因此需要设计有针对性的疫苗来预防PEDV。并且氨基酸序列分析表明，闽西毒株N基因与疫苗毒株CV777相比存在15處基因改变，但是与目前流行毒株相比没有明显变化，证明N基因是高度保守的，因而可以作为疫苗候选基因。本研究结果希望能从分子水平阐明闽西地区PEDV的遗传进化特征，同时希望为PEDV疫苗的设计提供资料基础。参考文献：

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