酶抑制法快速检测有机磷农药残留的比较试验

罗俊霞　赵建波　贾冬　尚航影　韩洛利　宋晓爽

摘要：采用6种商品化酶抑制法快速检测试剂盒对敌敌畏、喹硫磷、敌百虫、辛硫磷4种有机磷农药进行了快速测定。结果表明，6种试剂盒对4种有机磷农药的敏感性、检出限各不一样;6种试剂盒对4种有机磷农药抑制率与农药浓度的对数线性模拟回归的线性范围也不相同;取用3.0 mL的提取液和取用2.5 mL的提取液抑制率差别不大，仅有个别农药在个别浓度水平下有差异。酶抑制法快速检测试剂盒对各种有机磷农药的检测敏感性不同，在实际的检测工作中，建议对抑制率≥10%的样品进行复检，同时采用色谱质谱进行了定性定量分析。

关键词：酶抑制法;快速检测;有机磷农药;敏感性

中图分类号：O656         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）18-0115-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.18.028           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Comparative test of enzyme reagent method for rapid detection of

organophosphorus pesticide residues

LUO Jun-xia1，ZHAO Jian-bo2，JIA Dong1，SHANG Hang-ying1，HAN Luo-li1，SONG Xiao-shuang1

（1.Zhengzhou Agricultural Product Quality Inspection and Circulation Center，Zhengzhou 450006，China;

2.Zhengzhou Agricultural Technology Promotion Center，Zhengzhou 450006，China）

Abstract： Four organophosphorus pesticides， including dichlorvos， quinthion， trichlorfon and octamphos-methyl， were rapidly determined by six reagent kits of commercial enzyme inhibition. The results showed that the reproducibility of pesticide residue in the rapid detection kit by enzyme inhibition decreased with the increase of inhibition rate. The sensitivity and detection limit of each reagent box to several pesticides were different. The inhibition rate of each reagent box for the four pesticides is not the same as the linear regression range of the logarithm of the pesticide concentration. There was little difference between 3.0 mL extraction and 2.5 mL extraction during the test， and individual pesticides differed at individual concentration levels. Since the reagent box for rapid detection of pesticide residues by enzyme inhibition method has different sensitivity for the detection of various pesticides， it is recommended that the sample with a suppression rate of ≥10% be reexamined in the actual test work， and that the chromatographic mass spectrometry be used for qualitative quantification.

Key words： enzyme inhibition method; rapid detection; organophosphorus pesticide; sensitivity

近年來，各种农药在农业生产中使用越来越多，为应对市场发展的需求及加入WTO后国际市场的要求，国家加强了对农药残留的检测，对农产品的监管提出了更高的要求。农药残留是农药使用后残存于农产品、生物体及环境中的农药原体、有毒代谢物、降解物和杂质的总称[1]。而农药残留检测方法主要有仪器分析法、生物检测法和酶抑制法等。酶抑制法通过污染物对各种酶的抑制作用来表征污染物的综合毒性，相比仪器分析法，该法具有操作简单、快速等优点[2-6]，但酶的来源纷繁复杂，对各种有机磷和氨基甲酸酯类农药的敏感程度也不同[7-13]，姜露等[12]、温艳霞等[13]则更为深入地对植物酯酶中的麦麸酯酶和大豆酯酶进行了研究，刘永杰等[6]对羧酸酯酶进行了研究，黄志勇等[14]、汪葵等[15]将植物酯酶和胆碱酯酶进行了比较，郑艺华等[16]对动物酯酶中的鸡肝酯酶进行了研究，杨莉等[17]对猪肝酯酶与胆碱酯酶进行了比较，丁运华等[18]将3种不同来源的胆碱酯酶进行了比较试验，张宁[19]则对动物胆碱酯酶和植物胆碱酯酶进行了比对试验。基于这些研究，快速检测产品应运而生，但据调查市售的商品快速检测产品的酶源多数来源于动物酶源中的胆碱酯酶[20-27]，但商品化酶抑制法快速检测农药残留的试剂盒对各种农药的敏感程度需要使用单位进行甄别。

为了解基于酶抑制法的各种试剂盒对农药的敏感性，筛选出更适应于快速检测的酶抑制法检测试剂盒，对6种商品化酶抑制法快速检测有机磷农药残留的试剂盒进行试验比较，以期对试剂盒的生产起到参考作用。

1  材料与方法

1.1  仪器与试剂

CL-BIII型16通道农残速测仪（上海复博农业科技有限公司）;SHA-C型双重恒温水浴振荡器（杰瑞尔电器有限公司）;HH.W21-Cr 420型电热恒温水浴锅（北京三二八科学仪器有限公司）;WH-861型漩涡混合器;Rongtai 5 mL和Thermo 200 μL的移液枪;农药残留检测试剂盒的品牌分别是深圳A试剂盒、广州B试剂盒、东莞C试剂盒、厦门D试剂盒、湖北E试剂盒、深圳F试剂盒;由农业环境保护科研检测所生产的浓度为1 000 mg/L的敵敌畏、喹硫磷、敌百虫、辛硫磷等有机磷类农药标准品，使用时稀释成80 μg/mL的储备液。

1.2  试剂配制

6种商品化检测试剂盒里有缓冲试剂、酶试剂、显色剂和底物，缓冲试剂用500 mL的去离子水溶解，酶试剂（乙酰胆碱酯酶）、显色剂（二硫代硝基苯甲酸）和底物分别按照各试剂盒说明书的要求进行配制，具体方法见表1。

1.3  方法

1.3.1  试验分组  试验分别选用敌敌畏、喹硫磷、敌百虫、辛硫磷4种农药，每种农药设置5个浓度，分别为0.05、0.50、1.00、2.00、3.00 mg/kg，每个浓度重复测定3次。同时，根据针对每种有机磷农药每个浓度设置2个处理，为3.0 mL样品溶液或2.5 mL样品溶液。

1.3.2  样品的检测  分别取样品溶液3.0 mL或2.5 mL于10 mL试管中，依次加入0.1 mL的酶液、0.1 mL的显色剂，用旋涡混合振荡器混匀，再用电热恒温水浴锅在37 ℃水浴10 min，取出后加入0.1 mL的底物摇匀，立即放入仪器比色池中，用CL-BIII型16通道的农残速测仪测定3 min内的吸光度变化值ΔA。同时，设置缓冲液溶液作为对照。

1.3.3  重现性试验  通过试剂盒测定在不同浓度水平下对各种有机磷农药的抑制率，计算抑制率的平均值和相对标准偏差，根据相对标准偏差比较各试剂盒测定4种农药的重现性。

1.3.4  敏感性试验  6种试剂盒对4种有机磷农药抑制率与浓度的对数线性模拟回归，获得线性回归方程，计算出IC50和IC10。将IC10确定为检出限，将IC50确定为超标限，根据检出限比较6种试剂盒对4种有机磷农药的敏感性。

2  结果与分析

2.1  6种商品化试剂盒测定4种有机磷农药的重现性分析

由表2可知，在6种商品化试剂盒中B试剂盒测定有机磷农药的重现性最差，其次是D试剂盒;同时，对有机磷农药敏感程度越高的酶试剂或农药的浓度越高时测定有机磷农药的重现性越好。重现性最差的B酶试剂测定浓度为0.05 mg/kg的辛硫磷时，当提取液体积为3.0、2.5 mL时变异系数分别为7.8、9.2，其抑制率分别为15.3%、12.6%;其次是B试剂盒测定浓度为0.50 mg/kg的敌敌畏时，当提取液体积为3.0、2.5 mL时变异系数分别为7.7、7.8，其抑制率分别为14.7%、13.0%;再次是B试剂盒测定浓度为0.05 mg/kg的喹硫磷时，当提取液体积为3.0、2.5 mL时变异系数分别为2.4、6.6，其抑制率分别为18.4%、5.8%;D试剂盒测定浓度为0.05 mg/kg的敌敌畏时，当提取液体积为3.0、2.5 mL时变异系数分别为1.9、5.6，其抑制率分别为48.1%、33.3%。其他变异系数基本在5.0以下，重现性相对较好。

2.2  6种商品化试剂盒对4种有机磷农药的敏感性分析

2.2.1  6种商品化试剂盒对敌敌畏的敏感性比较  由图1可知，6种商品化试剂盒测定敌敌畏，提取液体积为3.0和2.5 mL，其折线图基本相同;B试剂盒测定时，敌敌畏浓度从0.05 mg/kg增加至3.00 mg/kg，其抑制率增幅最大，D试剂盒和F试剂盒增幅相差较小，C试剂盒和E试剂盒在最低浓度水平下，其抑制率就达100%或接近100%。从折线图可以看出，综合不同浓度测定结果，当提取液体积为3.0 mL 时，6种试剂盒对敌敌畏敏感性按照E试剂盒、C试剂盒、A试剂盒、D试剂盒、F试剂盒、B试剂盒的顺序依次降低。

2.2.2  6种商品化试剂盒对喹硫磷的敏感性比较  由图2可知，6种商品化试剂盒测定喹硫磷，提取液体积为3.0和2.5 mL时，其折线图除了A试剂盒有差异外，其他图形基本相似;C试剂盒和E试剂盒在测定浓度范围内增幅相差较小，不同浓度水平下抑制率达100%或接近100%。从折线图来看，综合不同浓度测定结果，提取液为2.5 mL和3.0 mL时分别测定喹硫磷，其敏感性分别按照C试剂盒、E试剂盒、F试剂盒、B试剂盒、A试剂盒、D试剂盒的顺序依次降低和E试剂盒、C试剂盒、D试剂盒、A试剂盒、F试剂盒、B试剂盒的顺序依次降低。

2.2.3  6种商品化试剂盒对敌百虫的敏感性比较  由图3可知，6种商品化试剂盒测定敌百虫，提取液体积为3.0和2.5 mL时，其折线图除了A试剂盒差别较大外，其他基本相同。从折线图来看，综合不同浓度测定结果，提取液为3.0 mL时，6种商品化试剂盒对敌百虫的敏感性按照D试剂盒、E试剂盒、C试剂盒、A试剂盒、F试剂盒（B试剂盒）的顺序依次降低;提取液为3.0 mL时，对敌百虫的感敏性按照D试剂盒、E试剂盒、C试剂盒、A试剂盒、B试剂盒（F试剂盒）的顺序依次降低。

2.2.4  6种商品化试剂盒对辛硫磷的敏感性比较  由图4可知，6种商品化试剂盒测定测定辛硫磷，提取液体积为3.0和2.5 mL时，其折线图基本相同。从折线图来看，综合不同浓度测定结果，6种商品化试剂盒对敌敌畏的敏感性按照C试剂盒（E试剂盒）、D试剂盒、B试剂盒、F试剂盒、A试剂盒的顺序依次降低。

2.3  6种商品化试剂盒测定4种有机磷农药相关性及检出限分析

2.3.1  6种试剂盒测定敌敌畏时相关性及检出限分析  由表3可知，6种试剂盒测定敌敌畏时，C试剂盒和E试剂盒线性范围比较窄，当浓度为0.5 mg/kg时，抑制率达到100%，在0.05～0.50 mg/kg的范围内只包含2个点，相关系数为1.000 0。A试剂盒、B试剂盒、D试剂盒、F试剂盒4种试剂盒测定敌敌畏在0.05～3.00 mg/kg范围内，提取液为3.0 mL和2.5 mL时，其抑制率和农药浓度的常用对数呈现良好的线性关系，相关系数分别为0.947 9、0.846 2、0.889 6、0.895 8;0.896 9、0.877 0、0.889 4。从IC50和IC10结果来看，按照E试剂盒、C试剂盒、A试剂盒、D试剂盒、B试剂盒、F试剂盒顺序对敌敌畏的敏感性逐渐降低。除了E试剂盒，F试剂盒、D试剂盒、C试剂盒、B试剂盒的检出限均是3.0 mL低于2.5 mL，就测定敌敌畏而言，取用3.0 mL的提取液比取用2.5 mL的提取液灵敏度更高。

2.3.2  6种试剂盒测定喹硫磷时相关性及检出限分析  由表3可知，6种试剂盒测定喹硫磷时，提取液为2.5 mL的C试剂盒和提取液为3.0 mL的E试剂盒均在浓度为0.05 mg/kg，其抑制率就达到100%;提取液为3.0 mL的C试剂盒和提取液为2.5 mL的E试剂盒均在浓度为0.5 mg/kg时抑制率就达到100%。B试剂盒、D试剂盒、F试剂盒3个品牌在0.05～3.00 mg/kg范围内，提取液为3.0 mL和2.5 mL时，其抑制率和农药浓度的常用对数呈现良好的线性关系，相关系数分别为0.981 8、0.994 3、0.950 6;0.985 8、0.988 7、0.960 7;就检出限来看，按照A试剂盒、F试剂盒、B试剂盒、D试剂盒、C试剂盒、E试剂盒的顺序依次降低，试剂盒灵敏度依次升高。

2.3.3  6种试剂盒测定敌百虫时相关性及检出限分析  由表3可知，6种试剂盒测定敌百虫时，其酶抑制率方程的线性范围不一致，在提取液体积为3.0 mL时，A试剂盒、D试剂盒两个品牌线性范围为0.05～3.00 mg/kg，B试剂盒、F试剂盒的线性范围为1.0～3.0 mg/kg，C试剂盒、E试剂盒的线性范围为0.05～2.00 mg/kg;在提取液体积为2.5 mL时，A试剂盒、D试剂盒、E试剂盒3个品牌线性范围为0.05～3.00 mg/kg，B试剂盒的线性范围为0.5～3.0 mg/kg，C试剂盒的线性范围为0.05～1.00 mg/kg，F试剂盒的线性范围为2.0～3.0 mg/kg。就检出限来看，按照F试剂盒、B试剂盒、A试剂盒、C试剂盒、E试剂盒、D的顺序依次降低，试剂盒的灵敏度依次升高。

2.3.4  6种试剂盒测定辛硫磷时相关性及检出限分析  由表3可知，6种试剂盒测定辛硫磷，提取液体积为3.0和2.5 mL时，C试剂盒和E试剂盒均在浓度为0.05 mg/kg时，其抑制率就达到100%，无法拟合抑制率和浓度对数的曲线;其他试剂盒抑制率和浓度的常用对数均在0.05～3.00 mg/kg范围内呈现较好的线性关系。就检出限来看，按照A试剂盒、F试剂盒、B试剂盒、D试剂盒的顺序依次降低，试剂盒的灵敏度依次升高。

3  结论

研究结果表明，6种商品化试剂盒对敌敌畏、喹硫磷、敌百虫、辛硫磷的敏感性均不相同，可能因为试剂盒中酶的来源不同、提取的方法不同或酶的纯度不同，说明试剂盒在酶的选择和提取上应该严格控制。在日常的检测工作中，使用A试剂盒，酶的重现性较高，不易受外界环境影响;而E试剂盒的重现性较差，受外界环境的影响较大。

按照蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残毒快速检测方法的国家标准和行业标准[28-32]，样品的抑制率达到50%则判定为样品超标，即是IC50所对应的浓度值，国家限量标准对每一种农药的限量不同，试剂盒对农药敏感性也不一，同时酶抑制法不能定性，因此在日常检测中只要抑制率高于10%的样品建议复检。

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