舌癌组织缺氧微环境中脂联素的表达与调控*

郭晓红 丁冲 张军林 赖晓晶 彭圆 吴丰华 殷明珠 李毅 赵刚

舌鳞状细胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）简称舌癌，是口腔癌中发病率最高的恶性肿瘤，治疗方法为手术、放疗、化疗等综合治疗，患者5年生存率仍然较低［1］，因而需明确其发病原因和影响因素，探寻积极有效的预防途径及治疗措施。

脂联素（adiponectin，APN）最初是在脂肪细胞中发现的一种脂肪因子，主要通过脂联素受体（adiponectin receptor，AdipoR）发挥作用［2］。大量研究表明，APN 与多种恶性肿瘤的发生和发展密切相关，在乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、胃癌、肾癌、结直肠癌等大部分肿瘤中发现血清APN 水平显著降低，并与肿瘤的发病进程呈负相关［3］。本研究前期结果表明，舌癌患者血清APN 水平低于健康人，低APN 水平增加舌癌的发病风险［4］。目前，仅在肝癌和胰腺癌等少数肿瘤中发现血清APN 水平升高［3］。起初认为由脂肪细胞分泌入血的血清APN 为APN 的唯一来源，然而后续研究发现，除脂肪细胞外，心肌细胞、成骨细胞、肝细胞等均可表达APN，提示APN不仅通过内分泌形式发挥其生物学作用，还可以通过旁分泌或自分泌形式发挥作用［5］。然而，关于局部组织合成的APN 及其受体的表达特征报道较少，其在肿瘤的发生发展过程中发挥何种作用尚未明确，有待深入研究。

缺氧微环境是实体肿瘤的重要特征［6］，缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）是缺氧微环境条件下可发挥活性的主要核转录因子，由α和β两个亚基组成，HIF-1α既是HIF-1的调节亚基，又是活性亚基，可与HIF-1β 聚合形成二聚体而活化，调控多种缺氧反应基因的表达［7］。心肌细胞方面的研究表明，APN是HIF-1α的下游靶基因［8］，但是舌癌缺氧微环境中，APN 相关的信号通路是否受到HIF-1α的调控有待深入揭示。本研究拟从组织和细胞水平两个方面展开研究，明确舌癌组织水平APN 及其受体在肿瘤及癌旁组织中的表达分布特征，探讨缺氧微环境条件下HIF-1α 对舌癌细胞APN 及其受体的表达调控作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

DMEM/F12 培养基（美国Thermo 公司）；胎牛血清（美国Hyclone 公司）；GAPDH、HIF-1α（美国Bioworld 公司）、Adiponectin（美国Abcam 公司）、AdipoR1、AdipoR2（美国Phoenix 公司）；山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗（美国Bioworld 公司）；RT-PCR 试剂盒和质粒提取试剂盒（美国Fermentas 公司）；CKAE1/AE3抗体和免疫组织化学试剂盒（北京中杉金桥生物有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 组织标本的收集及免疫组织化学法检测 舌癌标本收集于北京大学口腔医学院，共37例，每例均包括肿瘤实体及其配对的癌旁正常舌黏膜（距肿瘤边缘约2 cm 处采集）。10%福尔马林固定标本，石蜡包埋并连续切片（4 μm）。免疫组织化学切片经常规脱蜡水化后，于枸橼酸盐缓冲液（0.01 mol/L，pH 6.0）中行微波抗原修复5～10 min，3%H2O2室温孵育10 min，5%马血清室温封闭20 min 后加入一抗，4℃过夜孵育；第2天复温并用生物素标记的二抗室温下37℃孵育20 min，辣根过氧化物酶标记的亲和素37℃孵育30 min，3，3'-二氨基联苯胺（3，3'-diaminobenzidine，DAB）显色。采用德国LEICA 公司的550 IW 图像分析系统拍照分析，以细胞膜和细胞质出现棕黄色颗粒作为阳性细胞，免疫组织化学评分（immunoreactive score，IRS）参照Kaczorowski 等［9］的方法：IRS=平均染色强度×阳性染色率。平均染色强度和阳性染色率参照Leite 等［10］的方法采用Image J 软件分析。每张切片取5 个视野的IRS 平均值为该切片得分。肿瘤病理分级参照1997年世界卫生组织（WHO）口腔鳞状细胞癌分级标准［11］。肿瘤TNM分期参照2010年第7版美国癌症联合委员会（AJCC）标准［12］。

1.2.2 细胞培养及缺氧处理 人舌癌细胞系SCC9和SCC15 均购自美国ATCC 公司，培养于DMEM/F12 培养基中，其中含10%FBS、2.5 mmol/L L-谷氨酰胺、0.5 mmol/L 丙酮酸钠、1 200 mg/L NaHCO3、15 mmol/L HEPES、400 ng/mL 氢化可的松、100 U/mL 青霉素和100 g/mL 链霉素。于5%CO2，37℃恒温培养箱培养。缺氧微环境由三气培养箱（HF100 型，中国香港Heal Force 公司）建立，O2浓度1%，CO2浓度5%，N2浓度94%。舌癌细胞生长融合达到70%时，换新鲜培养基开始缺氧试验，分别于0、2、4、8、16 和24 h 收集各组细胞，提取mRNA或蛋白进行后续检测。

1.2.3 反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR） PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列见表1。引物冻干粉用无菌的TE（pH 8.0）溶解配制成100 μmol/L储存液后，-20℃冻存备用，使用前稀释至25 μmol/L。PCR所有操作于冰上完成，在反应体系中顺序加入：DEPC水9 μL，Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，反转录产物1.5 μL。PCR扩增条件：94℃预变性5 min，94℃45 s，适宜退火温度45 s，72℃60 s，30个循环后72℃充分延伸10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭结合后在紫外灯下观察，拍照。

1.2.4 蛋白质印迹法（Western blot）检测 用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA 法定量蛋白浓度，煮沸变性，每组分别上样40 μg进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离，用PVDF膜将分离蛋白质转膜，5%脱脂牛奶封闭，PBST洗膜，加入适宜浓度的一抗（HIF-1α、APN、AdipoR1和AdipoR2 均为1:1 000，GAPDH 为1:5 000），4℃摇床孵育过夜，二抗室温摇床孵育2 h，ECL显影，Syngene化学发光仪成像。

1.2.5 慢病毒包装及shRNA转染建立HIF-1α稳定敲低的细胞株 根据HIF-1α 基因的mRNA 序列，设计shRNA#1、shRNA#2和shRNA#3 RNA干扰序列：#1：5'-GATCCGTGATGAAAGAATTACCGAATTTCAAGAGAAT TCGGTAATTCTTTCATCACTTTTTG-3'；#2：5'-GATCCG TGCTCTTTGTGGTTGGATCTATTTCAAGAGAATAGATC CAACCACAAAGAGCACTTTTTG-3'；#3：5'-GATCCGC CGCTGGAGACACAATCATATTTCAAGAGAAATGATTG TGTCTCCAGCGGCTTTTTTG-3'。将合成的序列插入载体pPLK/EGFP/Puro中的BamH1和EcoR1之间，测序确认序列正确后，将纯化的产物转至DH5α感受态细菌，挑选阳性克隆，摇菌后抽提质粒DNA，再行测序，保存测序正确的克隆菌液。每组取菌液100 μL加入5 mL的LB液体培养基中，37℃摇床上摇菌18 h（225 g），后用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，测定质粒浓度；通过LipofectamineTM3000系统（美国Invitrogen公司）转染质粒于293T细胞进行慢病毒包装，Amicon®Ultra-15超滤柱浓缩病毒原液；转染前1天接种于24孔板，接种密度为每孔2×105个细胞，待细胞密度约为50%时感染细胞。开始感染时，细胞换液加一半的培养基，分别加入10μg/mL的polybrene和250 mL的慢病毒液，48 h后换为正常培养基继续培养，72 h 后用嘌呤霉素筛选阳性克隆，建立HIF-1α稳定敲低的细胞株。

1.3 统计学分析

采用SPSS 11.5软件进行统计学分析。结果以表示，组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 APN及其受体在舌癌组织中的分布

分别对APN、AdipoR1 和AdipoR2 进行免疫组织化学法染色以观察其分布，结果如图1所示，3个分子的棕黄色阳性染色均位于细胞胞膜和胞质。在癌旁上皮，APN主要分布于基底层细胞（图1A）；在高分化和中分化肿瘤中，APN 主要分布于癌巢中除角化珠外的肿瘤细胞，癌巢边缘的基底样细胞阳性染色最强（图1D，1G）；在低分化肿瘤中，APN 在肿瘤细胞中呈均一的阳性表达（图1J）。在癌旁上皮，AdipoR1和AdipoR2 在基底细胞层和棘细胞层均有较强的阳性表达，颗粒层表达较弱或呈阴性（图1B，1C）；在舌癌组织中，AdipoR1和AdipoR2的分布与APN 的分布相似（图1E，1F，1H，1I，1K，1L）。

图1 APN及其受体在舌癌组织中的分布（Bar=100 μm）

2.2 APN及其受体在舌癌及配对癌旁组织中的表达

根据IRS法［9］对免疫组织化学法染色结果进行免疫组织化学评分（immunohistochemistry score，IHC score），结果如表2所示，APN在舌癌组织中的表达显著高于其在癌旁组织的表达（P=0.006），在不同临床T分期的肿瘤及配对癌旁组织中（因T4期仅1例，故合并为T3+T4组），T1组和T2组肿瘤APN的表达较癌旁组织显著增加（T1组P=0.009；T2组P=0.016）；T1组肿瘤AdipoR1的表达较癌旁组织显著增加（P=0.007）；在不同淋巴结转移的肿瘤及配对癌旁组织中（因N2期肿瘤仅2例，故合并为N1+N2组），N0组肿瘤APN的表达较癌旁组织显著增加（P=0.014）。AdipoR2在各临床分期的肿瘤和癌旁组织间的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。提示在肿瘤发生早期，当肿瘤体积较小（≤4 cm）或未发生淋巴结转移时，肿瘤组织APN的表达与癌旁正常上皮相比上调；当肿瘤体积较小（≤2 cm）时，肿瘤组织AdipoR1的表达也较癌旁正常上皮上调。

2.3 缺氧对舌癌细胞APN及其受体表达的影响

HIF-1α免疫组织化学结果表明，舌癌中HIF-1α表达上调（图2A，2B），提示舌癌组织内部呈典型的缺氧状态。对人舌癌细胞系SCC9和SCC15细胞分别进行2、4、8、16 和24 h 持续缺氧，RT-PCR 结果表明，缺氧24 h 内，HIF-1α 和APN 的mRNA 表达在缺氧4 h时达到高峰，但随后逐渐下降；AdipoR1 mRNA 的表达在缺氧8 h 时达到高峰，到24 h 仍保持高表达，而缺氧处理不改变AdipoR2 mRNA 的表达（图2C）。Western blot结果表明，缺氧24 h内，两种细胞系HIF-1α及SCC9细胞的APN、AdipoR1表达从缺氧4 h开始上调一直持续到24 h，SCC15细胞的APN、AdipoR1表达从缺氧8 h 开始上调；但两种细胞系AdipoR2 蛋白的表达不变（图2D）。上述研究结果提示缺氧处理上调HIF-1α的表达，并激活APN-AdipoR1信号通路。

表2 舌癌及其癌旁组织中APN、AdipoR1和AdipoR2的免疫组织化学评分 （x±s）

图2 舌癌的缺氧微环境及缺氧处理对舌癌细胞APN及其受体表达的影响（Bar=100 μm）

2.4 HIF-1α对APN-AdipoR1通路的调控

明确舌癌细胞在缺氧条件下，APN-AdipoR1 通路是否受到HIF-1α 的调节，采用慢病毒转染shRNA技术敲低SCC9和SCC15细胞HIF-1α的表达，其转染效率可达90%以上（图3A），其中能有效敲低HIF-1α表达的为shRNA#3 号，在SCC9 和SCC15 细胞中的敲低效率分别约76%和66%（图3B）。对shRNA#3号稳定转染细胞系进行16 h 和24 h 缺氧处理。结果显示，敲低HIF-1α 组中APN 和AdipoR1 的表达均显著下调（图3C），说明缺氧微环境下舌癌细胞APN-AdipoR1通路的开放受到HIF-1α调控。

图3 敲低HIF-1α后缺氧处理对APN及其受体蛋白表达的影响

3 讨论

目前，关于肿瘤组织局部APN 表达变化的研究报道相对较少，仅在乳腺癌、胃癌和结直肠癌等肿瘤中有相关报道。Karaduman 等［13］采用ELISA 法检测27例乳腺癌和33例乳腺纤维瘤组织中APN 的表达，发现乳腺癌组织APN显著高于乳腺纤维瘤组织。在结直肠癌中的研究也发现，结肠癌组织APN 水平显著高于癌旁黏膜组织［14］，在胃癌中的研究不同，APN在胃癌细胞及正常胃黏膜上皮细胞中无表达，但可表达于基质细胞、肌细胞及周围的脂肪细胞等间质中［15］。作为对本研究组前期结果［4］的深入和拓展，本研究重点分析舌癌组织APN 的表达变化，结果表明在舌癌发病早期，肿瘤局部APN的表达上调，而在舌癌发病晚期，APN 的这种上调变得不明显。该结果与本研究组前期发现的舌癌患者血清APN水平显著下调并与发病进程负相关的结果相反，基于此，本研究进一步分析APN 的两个主要受体AdipoR1 和AdipoR2 在舌癌中的表达，旨在探明局部组织APN 的表达上调在舌癌发生发展过程中可能的生理意义。

AdipoR1 和AdipoR2 是APN 最经典的两个受体，在多种肿瘤组织及其癌旁组织中广泛表达并存在差异，但变化趋势不一。在肥胖相关的肿瘤研究中发现，结直肠癌AdipoR1 和AdipoR2 mRNA 与蛋白的表达高于癌旁组织［16］，肾癌AdipoR1 和AdipoR2 mRNA与蛋白的表达在肿瘤组织和癌旁组织无差异［17-18］，而宫颈癌AdipoR1 的表达［19］，以及前列腺癌、食管腺癌AdipoR1和AdipoR2的表达低于癌旁组织［20-21］。在非肥胖相关的肿瘤研究中发现，肺癌AdipoR1 和AdipoR2 蛋白的表达高于癌旁组织，胃肠道间质瘤AdipoR1、AdipoR2 mRNA和蛋白的表达与正常胃肠间质无差异，并发现结直肠癌中AdipoR1和AdipoR2的表达与肿瘤分级及体积大小相关［16，22］。目前，对出现这些差异的原因并未明确，推测可能与病理情况下受体对APN 的结合力或敏感性发生变化有关，某些肿瘤中APN受体的过表达可能是作为配体的血清APN水平降低的一种代偿性反应；而某些肿瘤中APN 受体表达水平不变或降低可能反映了疾病状态下细胞对APN 不敏感或敏感性降低，将影响APN 生物学功能的发挥，从而影响细胞的代谢及功能，成为促进肿瘤发生与发展的重要机制。本研究比较了舌癌患者的肿瘤及癌旁舌黏膜上皮中AdipoR1 和AdipoR2 蛋白水平的表达，提示无论恶性程度高低、肿瘤体积大小或是否发生淋巴结转移，AdipoR1的表达仅在肿瘤体积较小（≤2 cm）时出现上调，而AdipoR2 蛋白在肿瘤和癌旁组织中的表达均无差异。因舌癌肿瘤体积较小时局部组织APN的表达增加，此时AdipoR1表达的升高可能提示局部APN的作用增强。

尽管在乳腺癌和结直肠癌中均发现肿瘤组织局部APN表达的上调现象［13-14］，但其他前期研究并未分析导致肿瘤组织APN 上调的可能因素。Nakagawa等［23］发现低氧环境下（10%O2）饲养3 周的小鼠血浆APN 水平较常氧环境饲养的小鼠显著降低，而肺动脉组织APN蛋白的表达却较常氧环境饲养的小鼠肺动脉APN 蛋白的表达明显升高，提示特殊的代谢微环境可能会改变组织局部APN 的生成，引起血清APN 和局部组织APN 不一致的变化。基于此，本研究试图从肿瘤微环境的角度探讨组织APN表达上调的可能机制。肿瘤组织局部微环境以缺血、缺氧和酸中毒等为特征［24］，HIF-1α 是在乏氧微环境条件下可高度特异性发挥活性的转录因子。本研究及以往的研究均发现，舌癌组织中缺氧标志分子HIF-1α的表达显著上调，说明舌癌组织呈典型的缺氧微环境状态。在心肌细胞方面进一步研究表明APN 是HIF-1α 的下游靶基因［8］。本研究细胞实验发现，缺氧处理可在短时间内快速上调APN 和AdipoR1 在mRNA 水平的表达，并可持续上调HIF-1α、APN 和AdipoR1 在蛋白水平的表达，更重要的是，建立稳定敲低HIF-1α 的舌癌细胞系后，对其进行缺氧处理，发现APN 及AdipoR1 的表达也随之下调，说明APNAdipoR1 通路受到HIF-1α 的调控，提示舌癌组织局部APN及其受体的表达上调很可能是机体对发病早期肿瘤局部微环境改变的一种阶段性反应。

综上所述，本研究发现肿瘤组织水平的APN 及其受体AdipoR1 的表达在舌癌发病早期较癌旁组织明显上调，晚期时上调作用则不显著；进一步的细胞实验表明，缺氧处理可激活APN-AdipoR1信号通路，且该过程受到HIF-1α的调控，推测局部组织APN的上调很可能是机体对肿瘤微环境的阶段性适应反应。本研究结果提示，在临床研究中应考虑同时检测血清APN水平和组织APN水平来确定肿瘤的具体发病进程，这对于特定肿瘤的预防和监控具有重要的意义。本研究结果完善了人们对APN在舌癌发生发展中作用的认识，并为未来以APN 为抗肿瘤靶点提供了重要的辅助依据。