腹水草水提液对胃溃疡大鼠PGE2和COX-2表达的影响＊

张海霞 任伟铭 祁依佳 沈贵芳 赵伟春

（浙江中医药大学生命科学学院，浙江杭州 310053）

胃溃疡是临床上常见、多发性疾病。全球每年有1400多万人被诊断为胃溃疡，约400万人死于相关并发症。关于胃溃疡的发病机制，目前被广泛接受的是攻击因子和防御因子失衡学说。胃溃疡主要攻击因子有胃酸，肿瘤坏死因数，内皮素等。主要防御因子有NO及NO合成酶，前列腺素（PGs），表皮生长因子等。PGs不在细胞中贮存，一旦机体需要，能很快通过环氧合酶（COX）反应合成。COX-2诱导的直接结果是以前列腺素E（PGE）为主的PGs产物的合成增加，从而保护胃黏膜。PGE是最重要的胃黏膜保护因子之一，COX是PGs合成过程中重要的限速酶。在明确腹水草水提液抗大鼠乙醇型胃溃疡的效果的基础上，本文分析了腹水草水提液对PGE及COX-2的表达的影响，为明确腹水草对抗大鼠乙醇型胃溃疡的作用途径提供理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

SPF级SD大鼠48只，6～7周龄，体重180g～220g，雌雄各半，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。腹水草水提液的制备方法见沈贵芳等。RevertAidFirst Strand cDNA Synthesis 试剂盒（批号：00064478）。PGE2试剂盒（批号：CKE90201R），上海源叶生物科技有限公司。COX-2兔抗鼠多抗（批号：BA0738），武汉博士德生物工程有限公司生产。β-Actin Antibody和Goat Anti-Rabbit IgG-HRP（均购自艾比玛特生物医药（上海）有限公司生产。批号分别为：214673和214575）。

1.2 分组、给药与造模

将48只大鼠按性别分层随机化分成6组，每组8只。正常组和模型组灌胃生理盐水（4mL/只）；雷尼替丁组灌胃0.18%雷尼替丁混悬液（0.027g/kg·d，0.0054g/只，临床剂量的3倍）；腹水草各剂量组分别灌胃高、中、低剂量腹水草水提液(2.8、1.4、0.7g/kg·d，4mL/只)，1次/d，连续给药14d。第14d给药后1h，正常组灌胃1mL/只生理盐水，其余大鼠均灌胃1mL/只无水乙醇造模，造模前禁食自由饮水24h。

表1 腹水草水提液对PGE2含量的影响（±s，n=8）

图1 各组大鼠胃黏膜组织COX-2蛋白的Western Blot分析

图2 名组大鼠胃黏膜组织COX-2//β-actin的蛋白比较

1.3 胃黏膜组织中PGE2的测定

取部分胃组织于0℃下匀浆，于4℃下20000r/min离心20min，取上清液。采用抗体夹心ELISA方法，测定胃黏膜组织中PGE的含量。

1.4 胃黏膜组织中COX-2蛋白的测定

采用RIPA裂解液提取胃黏膜组织蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳采用10%的分离胶和5%的浓缩胶，将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上进行Western Blot分析。以COX-2/β-actin蛋白条带的密度比值作为COX-2的相对表达量。

1.5 胃黏膜组织中COX-2 mRNA的测定

采用Trizol试剂提取胃黏膜组织总RNA，经非变性琼脂糖凝胶电泳检验RNA的完整性后按照RevertAidFirst Strand cDNA Synthesis 试剂盒说明书合成cDNA第一链。COX-2的PCR扩增条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸1min，30个循环；72℃充分延伸8min；β-actin的PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性1min；60℃退火45s；72℃延伸1min，25个循环；72℃充分延伸10min；PCR扩增结束经琼脂糖凝胶电泳后利用凝胶成像系统进行扫描分析，以COX-2/β-actin比值表示各样本mRNA的相对含量。

1.6 数据统计分析

图3 各组大鼠胃黏膜组织COX-2 mRNA的RT-PCR扩增结果

图4 各组大鼠胃黏膜组织COX-2/β-actin的mRNA比较

2 结果

2.1 各组大鼠胃黏膜组织中PGE2含量的比较

结果见表1。模型组、雷尼替丁组和腹水草各剂量组大鼠胃黏膜组织PGE含量均显著低于正常组（

P

＜0.05，

P

＜0.01）。与模型组相比，腹水草各剂量组、雷尼替丁组的PGE含量均显著提高（

P

＜0.05，

P

＜0.01）。

2.2 各组大鼠胃黏膜组织中COX-2蛋白含量的比较

模型组、腹水草各剂量组和雷尼替丁组大鼠COX-2蛋白的表达量显著高于正常组（图1，图2）。与模型组比较，腹水草各剂量组和雷尼替丁组大鼠的COX-2蛋白水平显著增加（

P

＜0.01），其中腹水草高剂量组是模型组大鼠的3.9倍，是正常组大鼠的13.2倍。腹水草各剂量组大鼠的COX-2蛋白水平亦显著高于雷尼替丁组。腹水草低、中、高剂量组间的COX-2蛋白水平亦随着腹水草剂量的升高而提高（

P

＜0.01）。

2.3 各组大鼠胃黏膜组织中COX-2 mRNA的比较

正常组大鼠胃黏膜组织内COX-2 mRNA的表达量最低，COX-2/β-actin为0.071±0.018（图3，图4）。腹水草各剂量组、雷尼替丁组和模型组COX-2 mRNA水平均显著高于正常组，其中腹水草高剂量组是正常大鼠的11.4倍（

P

＜0.01）。雷尼替丁组、腹水草中剂量组和腹水草高剂量组的COX-2 mRNA的表达量高于模型组（

P

＜0.01）。腹水草各剂量组间COX-2 mRNA的表达量差异不显著（

P

＞0.05）。

3 讨论

PGE是最重要的胃黏膜保护因子之一，但其保护胃黏膜的机制尚未阐明。一般认为，与其促进黏液及HCO的分泌，改善细胞内对H+的中和能力，增加表面疏水性、保护黏膜屏障、调节胃黏膜血流量等有关。已有研究表明，双蒲散提高溃疡愈合质量的机制可能是增加胃黏膜组织PGE含量，促进黏膜修复。酒速愈可通过升高胃黏膜PGE含量，加强胃黏膜的黏液—碳酸氢盐屏障，减轻乙醇对胃黏膜的损伤。腹水草具有去腐生肌和散血逐瘀的作用，本实验表明，腹水草水提液通过促进胃组织中PGE的合成及释放来保护胃黏膜。

PGE在体内由花生四烯酸(arachidonic acid，AA)所合成。细胞膜磷脂在磷脂酶A的作用下生成花生四烯酸，花生四烯酸在环氧合酶的作用下生成环内过氧化物前列腺素G(PGG)、前列腺素H(PGH)。PGH很不稳定，很快转变成前列腺素E(PGE)和血栓素A(TXA)等物质。研究认为，在正常大鼠胃黏膜组织中，COX-2蛋白几乎无表达，COX-2 mRNA的表达量很少；但在胃溃疡发生或溃疡愈合的过程中，COX-2蛋白大量表达，COX-2 mRNA的表达量急剧上升。本实验结果亦表明，腹水草水提液能提高COX-2 mRNA和COX-2蛋白表达量，促使胃黏膜组织中PGE2含量增加，进而调节胃粘液及黏膜血流量，保护黏膜屏障，从而抑制胃溃疡的发生。