HPLC法同时测定炎立消胶囊中5种成分的含量

张妤琳 ，沈晔

(1.江苏省食品药品监督检验研究院，江苏 南京 210019； 2.嘉兴市第一医院，浙江 嘉兴 314000)

炎立消胶囊是以丁香叶为原料提取制得的胶囊剂，具有清热解毒、消炎止痢等功效，临床上用于属于热症的细菌性痢疾、急性扁桃体炎、急慢性支气管炎、急性肠胃炎、急性乳腺炎等感染性疾病[1-6]。丁香叶为木犀科丁香属植物紫丁香SyringaoblateLindl.、朝鲜丁香SyringadiatataNakai.或洋丁香SyringavulgarisL.的干燥叶，该属植物为落叶灌木，在东北地区分布较广，资源丰富，是庭院绿化的主要树种。研究表明，丁香叶是一种理想的广谱抗菌药，具有显著的抗菌消炎作用，所含的有效成分主要有有机酸类、苷类以及挥发油等，其中原儿茶酸、原儿茶醛、酪醇、咖啡酸、紫丁香苷、丁香苦苷等具有较强的抑菌作用，为其主要活性物质[7-11]。炎立消胶囊现行的法定标准大部分只有原儿茶酸的含量测定项，且多为紫外分光光度法，专属性和准确性都较差[12]。目前对炎立消胶囊多组分同时测定的报道较少，且包含的组分不够全面[13-14]，为进行有效的质量控制，更全面合理地评价该制剂的整体质量，我们建立了HPLC同时测定炎立消胶囊中原儿茶酸、原儿茶醛、酪醇、紫丁香苷和咖啡酸质量分数的方法。

1 仪器与试药

LC-20AB高效液相色谱仪，LC solution色谱工作站(日本岛津公司，PDA检测器)；KH-700TDB型高频数控超声波清洗器(昆山禾超超声仪器有限公司)；BS21S 型电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)。

原儿茶酸(批号100049-201009，质量分数99.9%)，原儿茶醛(批号110810-201608，质量分数99.3%)，酪醇(批号111676-200602，质量分数100%)，紫丁香苷(批号111574-201605，质量分数95.2%)，咖啡酸(批号110885-201703，质量分数99.7%)均购自中国食品药品检定研究院；炎立消胶囊15批[葵花药业集团(吉林)临江有限公司，批号20170201、20170701、20180202；吉林省正和药业集团股份有限公司，批号170901、171201、180202；通化斯威药业股份有限公司，批号171001、171201、180101；修正药业集团股份有限公司，批号171104、180105、180301；黑龙江龙桂制药有限公司，批号171102、171201、180101]。硬脂酸镁由葵花药业集团(吉林)临江有限公司提供。甲醇、冰醋酸均为色谱纯，水为去离子水，其余均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 混合对照品溶液的制备

分别取原儿茶酸、原儿茶醛、酪醇、紫丁香苷、咖啡酸对照品25.890、5.105、50.400、25.340、5.083 mg，精密称定，分别置于100、100、50、100、100 mL容量瓶中，用50%(体积分数，下同)甲醇制成质量浓度分别为0.258 6、0.050 7、1.008 0、0.241 2、0.050 7 mg/mL的对照品储备溶液。

精密量取原儿茶酸、原儿茶醛、酪醇、紫丁香苷、咖啡酸各对照品储备溶液2、5、5、2、1 mL置于50 mL量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，即得质量浓度分别为10.345 6、5.069 3、100.800 0、9.649 5、1.013 6 μg/mL的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备

取本品0.5 g，置锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，摇匀，称定质量，超声处理30 min(功率250 W，频率35 kHz)，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，静置，取上清液滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 阴性对照溶液的制备

炎立消胶囊处方为丁香叶单味药，取辅料硬脂酸镁0.5 g，按“2.1.2”项下方法，制得不含丁香叶的阴性对照溶液。

2.2 色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agela Durashell RP C18柱，4.6 mm×250 mm，5 μm)；以甲醇为流动相A，以1%(体积分数，下同)冰醋酸溶液为流动相B进行梯度洗脱：0～20 min，8%A；20～30 min，8%A→15%A；30～40 min，15%A→20%A；40～50 min，20%A→8%A。流速为1.0 mL/min，柱温为35 ℃，原儿茶酸、原儿茶醛、酪醇、紫丁香苷检测波长为275 nm，咖啡酸检测波长为322 nm。

2.3 系统适用性试验

分别取“2.1”项下混合对照品、供试品、阴性对照溶液，按“2.2”项下色谱条件进样10 μL进行测定。5种成分与相邻峰之间分离度均大于1.5，阴性对照对测定无干扰，见图1。

100806040200mAU1008060402001008060402005040302010012435123541015202530354005101520253035400510152025303540051015202530354005ABCDt/mint/mint/mint/min

1.原儿茶酸； 2.原儿茶醛； 3.酪醇； 4.咖啡酸； 5.紫丁香苷；A.对照品溶液(275 nm)； B.对照品溶液(322 nm)； C.供试品溶液(275 nm)； D.供试品溶液(322 nm)。

图1炎立消胶囊多组分测定的HPLC色谱图
Figure1HPLC Chromatograms of Yanlixiao capsules

2.4 线性关系的考察

精密量取“2.1.1”项下原儿茶酸对照品储备溶液0.02、0.2、0.4、2、5、10 mL，原儿茶醛对照品储备溶液0.1、1、2、5、10、15 mL，酪醇对照品储备溶液0.5、1、2.5、5、7.5、10 mL，紫丁香苷对照品储备溶液0.2、0.5、1、2、5、10 mL，咖啡酸对照品储备溶液0.1、0.2、0.5、1、2.5、5 mL，分别置于50 mL量瓶中，用50%(体积分数，下同)甲醇稀释至刻度，即得系列混合对照品溶液。精密吸取各混合对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件下分别进样10 μL测定，记录色谱图。以对照品质量浓度(ρ)为横坐标，色谱峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线，得原儿茶酸、原儿茶醛、酪醇、紫丁香苷、咖啡酸的回归方程分别为A=1.647 5×104ρ-8.770 7×102(r=0.999 9)、A=3.967 9×104ρ-1.396 6×103(r=0.999 9)、A=5.781 1×103ρ+2.826 5×103(r=0.999 9)、A=1.823 0×104ρ-1.617 4×103(r=0.999 9)、A=5.035 3×104ρ+6.700 7×102(r=0.999 9)。结果表明，原儿茶酸、原儿茶醛、酪醇、紫丁香苷、咖啡酸在0.103 5～51.728 2、0.101 4～15.207 8、10.08～201.6、0.964 9～48.247 4、0.101 4～5.067 8 μg/mL范围内线性关系良好。

2.5 重复性试验

取同一批炎立消胶囊(批号20170701)，按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件分别进样10 μL测定，原儿茶酸、原儿茶醛、酪醇、紫丁香苷、咖啡酸的质量分数分别为0.507 3、0.034 3、1.963 1、0.704 4、0.204 6 mg/g，RSD值(n=6)分别为0.9%、1.6%、1.6%、1.4%和1.1%，表明本方法重复性良好。

2.6 精密度试验

取“2.1.1”项下混合对照品溶液(原儿茶酸、原儿茶醛、酪醇、紫丁香苷、咖啡酸质量浓度分别为10.345 6、5.069 3、100.800 0、9.649 5、1.013 6 mg/mL)，按“2.2”项下色谱条件分别进样10 μL，连续进样6次，记录峰面积。原儿茶酸、原儿茶醛、酪醇、紫丁香苷、咖啡酸色谱峰面积的RSD值(n=6)分别为0.2%、0.2%、0.2%、0.2%、1.4%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取同一批炎立消胶囊(批号20170701)，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12、24 h，按“2.2”项下色谱条件分别进样10 μL测定，结果原儿茶酸、原儿茶醛、酪醇、紫丁香苷、咖啡酸色谱峰面积的RSD值(n=8)分别为0.7%、1.1%、0.8%、0.9%、0.8%，表明供试品溶液室温放置24 h内稳定。

2.8 加样回收率试验

取已知质量分数的炎立消胶囊(批号20170701，原儿茶酸、原儿茶醛、酪醇、紫丁香苷、咖啡酸质量分数分别为0.507 3、0.034 3、1.963 1、0.704 4、0.204 6 mg/g)6份，每份精密称取0.25 g，置锥形瓶中，分别精密加入“2.1.1”项下对照品储备溶液原儿茶酸0.5 mL、原儿茶醛0.15 mL、酪醇0.5 mL、紫丁香苷0.7 mL、咖啡酸1 mL，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，摇匀，称定质量，超声处理30 min(功率250 W，频率35 kHz)。放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，静置，取上清液，滤过，取续滤液，即得。原儿茶酸、原儿茶醛、酪醇、紫丁香苷、咖啡酸的平均加样回收率分别为98.9%、98.8%、101.1%、101.3%、95.2%，RSD值(n=6)分别为2.8%、1.3%、3.0%、4.0%、2.1%，表明方法准确性良好。

2.9 样品测定

取15批炎立消胶囊，分别按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，每批平行制备供试品溶液2份，按“2.2”项下色谱条件分别进样10 μL测定，按标准曲线法计算炎立消胶囊中原儿茶酸、原儿茶醛、酪醇、紫丁香苷、咖啡酸的质量分数，结果见表2。

3 讨论

炎立消胶囊中原儿茶酸、原儿茶醛、酪醇、紫丁香苷、咖啡酸的最大吸收波长分别为260、280、275、265、322 nm，综合考虑，选择双波长275、322 nm进行测定。

比较了乙腈-0.1%H3PO4系统和甲醇-1%冰醋酸溶液系统，以及3种色谱柱[Agela Durashell RP C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Agilent Zorbax SB-Aq C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Phenomex Luna C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)]，结果在使用Agela Durashell RP C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱、流动相为甲醇-1%冰醋酸溶液系统梯度洗脱时，5种成分分离最佳，色谱行为良好。

表1 炎立消胶囊中5种成分的加样回收率结果Table 2 1 The recoveries of five constituents in Yanlixiao capsules (n=6)

表2 炎立消胶囊中5种成分的质量分数测定结果

Table2The content of five constituents in Yanlixiao capsules (n=2)w/(mg·g-1)

编号生产企业批号原儿茶酸原儿茶醛酪醇紫丁香苷咖啡酸S1葵花药业集团(吉林)临江有限公司201702010.793 3 0.058 4 3.410 3 1.179 4 0.325 7 S2201707010.507 3 0.034 3 1.963 1 0.704 4 0.204 6 S3201802020.525 3 0.027 4 2.721 6 0.655 4 0.193 8 S4吉林省正和药业集团股份有限公司1709010.387 7 0.050 8 3.498 6 0.373 2 0.036 4 S51712010.324 4 0.045 1 3.167 0 0.529 5 0.044 3 S61802020.343 7 0.032 9 4.745 2 0.553 5 0.079 1 S7通化斯威药业股份有限公司1710010.310 9 0.039 6 0.921 7 0.691 7 0.122 8 S81712010.334 0 0.040 0 0.801 3 0.587 6 0.120 9 S91801010.511 9 0.031 2 1.957 0 0.483 2 0.110 6 S10修正药业集团股份有限公司1711040.281 6 0.038 5 3.865 0 0.384 5 0.102 1 S111801050.315 2 0.023 5 2.566 3 0.435 2 0.075 1 S121803010.398 7 0.030 6 3.122 6 0.362 2 0.072 6 S13黑龙江龙桂制药有限公司1711020.174 1 0.028 4 0.841 1 0.659 6 0.069 1 S141712010.358 1 0.036 8 1.025 6 0.460 3 0.109 9 S151801010.356 1 0.022 3 1.060 4 0.433 4 0.138 8

比较了不同提取方法(超声以及加热回流提取)、不同提取溶剂(甲醇、50%甲醇、80%甲醇)、不同提取时间(15、30、45 min)的提取效果，最终，选择了50%甲醇超声提取30 min作为供试品溶液制备方法。

目前,炎立消胶囊的现行标准大多以原儿茶酸做参照，供试品溶液采用索氏提取法制备，采用紫外分光光度法测定，得到的是酚酸类成分的质量分数总和，其专属性不够，不能准确全面地表征该制剂各有效成分的质量分数[12]。此外，炎立消胶囊标准中丁香叶来源于3个种(紫丁香、朝鲜丁香、洋丁香)，各个种中原儿茶酸等5种成分的质量分数高低有所不同。从测定结果来看，5种成分的质量分数并非呈现正相关性，而是有高有低，例如S1样品中原儿茶酸、原儿茶醛、紫丁香苷、咖啡酸的质量分数均最高，而酪醇质量分数略高于均值，S6样品中酪醇质量分数最高，其余成分则处于均值附近，S12样品紫丁香苷质量分数最低，但其余4种成分质量分数并不低，处于均值上下，提示我们各成分的质量分数的差异应与各企业投料的丁香叶种属密切相关。制剂的疗效是其各有效成分的协同综合作用，仅以某一成分来评价显然不够合理，本文方法可进一步用来探索丁香叶各个种属间各有效成分质量分数之间的相关性，从而有效指导投料药材以及更全面合理有效地评价该产品质量。