超高效液相色谱-串联质谱法测定柑橘中甲基硫菌灵及其代谢物残留

凌淑萍，叶时民，付岩，王全胜，张亮，吴银良

(宁波市农业科学研究院，浙江 宁波 315040)

柑橘(CitrusreticulataBlanco)属芸香科植物。我国是世界上柑橘生产第一大国，资源丰富，优良品种繁多。浙江每年加工出口罐头消耗鲜橘约25万t，为浙江柑橘产业发展创造良好的经济效益与社会效益。柑橘果实适宜于全果资源化利用，柑橘果汁和橘瓣罐头均是水果中第一大同类加工品[1]。2016年初，我国出口美国的柑橘罐头被FDA检出多菌灵超标而退货，其中包括浙江的个别罐头厂[2]。如再次查出多菌灵超标，对我国柑橘罐头产业会造成不良影响。

甲基硫菌灵(甲基托布津)是一种广谱性内吸低毒杀菌剂，在柑橘中常用于防治疮痂病和炭疽病等。甲基硫菌灵被植物吸收后，通过一系列的生化反应，转化为另一种苯并咪唑类杀菌剂多菌灵，通过干扰病原菌有丝分裂中纺锤体的形成，影响细胞分裂，起到杀菌作用。多菌灵性质稳定，可通过叶片和种子渗入植物体内，耐雨水冲洗，残效期长。苯菌灵和多菌灵同属于苯并咪唑类内吸式杀菌剂。由于多菌灵对哺乳动物有一定的生殖毒性，在植物中残留期较长，可通过食物链威胁人体健康[3]。苯菌灵的检测方法是通过转化成多菌灵，以多菌灵进行计算。对甲基硫菌灵残留物定义为甲基硫菌灵、多菌灵和苯菌灵之和，以多菌灵表示。因此，在测定甲基硫菌灵的同时要测定多菌灵和苯菌灵。

目前，我国关于甲基硫菌灵、多菌灵和苯菌灵的检测方法主要有高效液相法[4-5]、液相色谱串联质谱仪法[6-8]、气相色谱法、薄层色谱法、免疫学方法和生物法[4]等。高效液相色谱法选择性差，灵敏度不高；气相色谱法样本前处理复杂；薄层色谱法灵敏度低；免疫学方法如荧光免疫法操作比较复杂且易受干扰。薛霞等[9]采用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)测定化妆品中苯菌灵和多菌灵。张志勇等[10]采用HPLC-MS/MS测定黄瓜和土壤中的甲基硫菌灵和多菌灵。但甲基硫菌灵、苯菌灵和多菌灵3种药物在柑橘中的残留检测报道较少。本文基于QuEChERS样品前处理技术，研究采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)测定柑橘中甲基硫菌灵、苯菌灵和多菌灵残留量的检测方法。该方法定量准确，灵敏度高，为有效监控甲基硫菌灵、苯菌灵和多菌灵在柑橘上的残留风险提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LC-MS/MS(Waters)，色谱柱Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，恒温振荡器(IKA KS4000ic)，高速离心机(Sigma 3K15)，高速匀浆机(IKA T25)，旋涡混合器(IKA GENIUS3)，烘箱(STIK BAO-112A)，离心管，电子天平，以及其他实验室常用仪器设备等。

甲基硫菌灵、苯菌灵、多菌灵标准品纯度分别为98.90%、98.00%、99.60%，均购自Dr.Ehrenstorfer；乙腈、乙酸铵为色谱纯。

1.2 样品前处理方法

称取试验(柑橘全果、果肉)样品5.00 g，置于50 mL离心管中，加入15.0 mL乙腈，振荡提取30 min后加入2 g氯化钠剧烈震荡1 min，再以9 500 r·min-1离心3 min，吸取上清液0.3 mL至另一试管中，并加入纯水至1.0 mL，混合均匀，过0.22 μm滤膜后供LC-MS/MS测定。

1.3 标准溶液配制

标准储备液配制。准确称取10.13 mg甲基硫菌灵标准品于10.00 mL容量瓶中，用色谱纯乙腈定容，混匀得到1 002 mg·L-1标准储备液；准确称取10.18 mg苯菌灵标准品于10.00 mL容量瓶中，用色谱纯乙腈定容，混匀得到998 mg·L-1标准储备液；准确称取25.10 mg多菌灵标准品于10.00 mL容量瓶中，用乙腈与0.1 mol盐酸(体积比为9∶1)混合溶液定容，混匀得到1 000 mg·L-1标准储备液。

混合基质标准工作液配制。将甲基硫菌灵、苯菌灵和多菌灵分别用定溶液稀释成浓度为100 mg·L-1的标准中间液。再用乙腈配制成浓度为10 mg·L-1混合标准工作液。以柑橘全果或果肉空白基质液与纯水(体积比为3∶7)作为稀释液，将混合标准工作液梯度稀释成1.000、0.500、0.250、0.100、0.050、0.010、0.005、0.001 mg·L-1不同浓度的基质标准工作液。

1.4 仪器条件

色谱柱柱温35 ℃，样品室温度15 ℃，进样体积10.0 μL。流动相为5 mmol乙酸铵(A)和乙腈(B)，采用梯度淋洗，具体如表1。

表1 甲基硫菌灵、多菌灵和苯菌灵流动相梯度洗脱条件

电喷雾离子源，正离子扫描，多重反应监测，电离电压2.5 kV，雾化气流速1 000 L·h-1；源温150 ℃；雾化温度500 ℃。具体如表2。

表2 多重反应监测条件

注：*为定量离子。

由于苯菌灵在前处理过程中有一部分会转化为多菌灵，因此，计算苯菌灵的回收率时，同时检测苯菌灵和多菌灵，并折合成苯菌灵计算其回收率。

2 结果与分析

2.1 标准溶液曲线与灵敏度

将甲基硫菌灵、苯菌灵和多菌灵标样用柑橘空白样品(基质)提取稀释液成不同浓度的标准基质工作溶液，按1.4节仪器条件下进样检测，甲基硫菌灵、苯菌灵和多菌灵的保留时间分别为2.73、3.29、1.48 min左右，得到MS响应值(峰面积，Y)与进样浓度(X)的线性回归方程。当甲基硫菌灵在柑橘全果基质中进样浓度为0.001～0.500 mg·L-1时，二者呈线性关系，相关系数r为0.997 7，Y=14 874 139X+213 647；当甲基硫菌灵在柑橘果肉基质中进样浓度为0.001～0.500 mg·L-1时，二者呈线性关系，相关系数r为0.995 7，Y=15 996 032X+281 618；当多菌灵在柑橘全果基质中进样浓度为0.001～0.500 mg·L-1时，二者呈线性关系，线性回归方程以及相关系数r为0.995 0，Y=27 025 330X+541 145；当多菌灵在柑橘果肉基质中进样浓度为0.001～0.250 mg·L-1时，二者呈线性关系，线性回归方程以及相关系数r为0.995 6，Y=39 147 025X+388 591；当苯菌灵在柑橘全果基质中进样浓度为0.001～0.500 mg·L-1时，二者呈线性关系，线性回归方程以及相关系数r为0.999 9，Y=11 711 299X+1 252；当苯菌灵在柑橘果肉基质中进样浓度为0.001～0.500 mg·L-1时，二者呈线性关系，线性回归方程以及相关系数r为0.996 7，Y=21 651 339X+303 727。在上述条件下，根据标准曲线最低浓度0.001 mg·L-1，进样量10 μL计算，甲基硫菌灵、多菌灵和苯菌灵最小检出量均为5.0×10-12g。

2.2 添加回收率与相对标准偏差

按上述色谱条件及检测步骤，由表3～5可知，甲基硫菌灵在柑橘全果和柑橘果肉中的添加浓度为0.01～5.00 mg·kg-1，平均回收率为92%～104%和90%～95%，相对标准偏差最大值为7%；多菌灵在柑橘全果和柑橘果肉中的添加浓度为0.01～5.00 mg·kg-1，平均回收率为76%～85%和77%～100%，相对标准偏差最大值为6%；苯菌灵在柑橘全果和柑橘果肉中的添加浓度为0.05～5.00 mg·kg-1，平均回收率为77%～88%和86%～90%，相对标准偏差最大值为7%，符合《农作物中农药残留试验准则》中的相关要求。

表3 柑橘果实甲基硫菌灵的添加回收率

表4 柑橘果实中多菌灵的添加回收率

表5 柑橘果实中苯菌灵的添加回收率

3 小结

本研究建立了一种同时测定甲基硫菌灵、苯菌灵和多菌灵残留分析方法：联合应用QuEChERS技术和超高效液相色谱串联质谱法对柑橘中甲基硫菌灵、苯菌灵和多菌灵进行残留量测定。试验结果表明，该方法前处理操作简单，净化效果好，精确度、准确度、检出限和回收率等均符合农药残留分析要求，为有效监控柑橘中甲基硫菌灵、苯菌灵和多菌灵提供可靠的技术支持。