失荅剌知丸及其拆方对脑缺血再灌注大鼠海马区JNK蛋白表达的影响

王娜琳 贾孟辉2，3* 左艳丽2 冯佳婷 马玉玮

1.宁夏医科大学中医学院，宁夏 银川 750004；2.宁夏医科大学第二附属医院，宁夏 银川 750001；3.宁夏医科大学回医药现代化教育部重点实验室，宁夏 银川 750004

脑缺血再灌注损伤(Cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)是指脑组织缺血性卒中发生时经过机械或化学治疗后，脑血管血流重建而引起的损伤[1]，其损伤的主要形式是神经细胞的凋亡，临床以神经功能损伤为主要症状。JNK即应激活化蛋白激酶(stress activated kinase,SAPK),是MAPK家族的主要成员之一[2]。研究表明，JNK信号通路与细胞凋亡过程密切相关[3]，其可促进大鼠脑缺血再灌注海马区神经元的凋亡[4]。本课题组前期研究已证实，失荅剌知丸可改善CIRI大鼠神经功能损伤症状，促进神经干细胞增殖，抑制神经细胞凋亡[5-7]。脑缺血再灌注模型是最接近人类脑梗死的理想大脑中动脉缺血(middle cerebral artery occlusion，MCAO)再灌注模型[8]。因此，本实验通过对失荅剌知丸及其拆方对脑缺血再灌注模型大鼠JNK信号通路的影响观察，以进一步探讨失荅剌知丸原方组成及各部分不同效果。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 本实验动物由宁夏医科大学动物实验中心提供，实验动物合格证号：SCXK(宁)2015-0001。用SPF级体重为(230±20)g的SD雄性大鼠102只。大鼠适应饲养7 d后，按随机数字表法分为假手术组(A组，6只)，正常组(B组，6只)，模型组(D组，18只)，干预组：包括失荅剌知丸组(E组，18只)、拆方Ⅰ组(C组，18只)、拆方Ⅱ组(F组，18只)、拆方Ⅲ组(G组，18只)。模型及各干预组按时间点不同又分别分为1 d、3 d、7 d组。

1.2 药物 失荅剌知丸：柴胡31 g，黑诃子31 g，撒额冰(阿魏)9 g，芦荟62 g，白芥子9 g，失荅剌知(血根草)6 g，沙哈木罕荅里(药西瓜)9 g，胡椒3 g，安息香9 g，巴豆霜9 g，菖蒲6 g，番盐6 g，阿里公(松蕈)9 g，干姜9 g，荜拨9 g，芸香9 g(《回回药方》原配方比例折算成公制克，药物剂量换算依据：一两约等于16.5克)。

拆方Ⅰ组：巴豆霜9 g；拆方Ⅱ组：巴豆霜9 g，柴胡31 g，黑诃子31 g，芦荟62 g；拆方Ⅲ组：巴豆霜9 g，撒额冰(阿魏)9 g，白芥子9 g，失荅剌知(血根草)6 g，沙哈木罕荅里(药西瓜)9 g，胡椒3 g，安息香9 g，菖蒲6 g，番盐6 g，阿里公(松蕈)9 g，干姜9 g，荜拨9 g，芸香9 g。

药物由宁夏医科大学第二附属医院药剂科提供，上各方按传统煎煮法煎煮并浓缩，浓缩药物浓度为4.5 g/mL。

1.3 造模 模型组及各干预组采用改良的Longa造模法[9]，即线栓法制备大鼠左侧中动脉供血不足的脑缺血再灌注(MACO)模型。造模方法：术前禁食12 h，予水合氯醛腹腔注射麻醉，大鼠取仰卧位，固定四肢及头部，备皮暴露颈部皮肤并消毒，沿颈中线开一约2 cm开口，钝性分离大鼠左侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉，将消毒好的线栓插入5 mL注射器针头，线栓钝圆头漏于注射器针尖外部，沿颈外动脉靠近三者分叉处向颈总方向插入约5 mm，借助注射器针头继续将线栓插入颈总后拔出注射器针头，将线栓轻轻缓慢退出至分叉处后插入颈内动脉，插入深度约16～18 mm，用缝合线将线栓固定，缝皮，2 h后打开缝合线，拔线栓至有阻力时停止，剪去线栓，缝合黏膜及皮肤，消毒。期间均使大鼠位于干净温暖的笼盒中，待大鼠清醒后单独饲养观察。

1.4 干预治疗 各干预组药物根据大鼠体表面积剂量换算公式[10]计算给药量为4.5 g/mL，给药剂量为1 mL/100 g、2次/d。剩余各对照组(正常组、假手术组、模型组)均以生理盐水灌胃，灌胃剂量同药物剂量即1 mL/100 g、2次/d。

1.5 取材方法 各干预组及模型组取材时间依据各不同时间点进行，正常组及假手术组于灌胃7 d后取材。以水合氯醛腹腔麻醉法进行大鼠麻醉后断头处死，快速取出脑组织，并于冰上迅速剥离海马保存于-80℃冰箱中。

1.6 指标检测方法

1.6.1 神经功能评分 取材前进行大鼠神经功能评分并记录，评分采用Garcia JH评分[11]，通过评估各组大鼠自主运动情况、体态的对称性、前肢伸展运动、网屏实验、两侧身体触觉反射及两侧胡须触觉反射情况，评分统计，评分区间为0-18分。

1.6.2 Western Blot检测蛋白表达水平 实验按照WB检测方法进行操作，用ImagaJ软件分析灰度值，以目的蛋白/内参即p-JNK/GADPH灰度值的比值表示蛋白表达水平。

1.7 统计学方法 采用SPSS21.0进行数据整理分析，各组数据先进行正态分布检验及方差齐性的检验，其中，符合正太分布及方差齐的，组间比较采用单因素方差分析，不符合的进行数据转换后分析；多组间比较则采用LSD法进行量量比较。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能Garcia JH评分 如表1所示，正常组与假手术组同期比较差异无统计学意义(P>0.05)。与正常组及假手术组比较，模型组及各干预组评分均低于空白组及假手术组(P<0.05)。与灌胃1 d组比较，模型组及各干预组灌胃3 d、7 d组评分均明显增加(P<0.05)。与灌胃3 d组比较，模型组及各干预组灌胃7 d时评分均明显增加(P<0.05)。与模型组同期比较，各干预组评分均高于模型组(P<0.05)。与失荅剌知丸组同期比较各拆方组评分均低于失荅剌知丸组(P<0.05)。与拆方Ⅰ组同期比较，拆方Ⅱ、Ⅲ组评分均高于拆方Ⅰ组(P<0.05)。与拆方Ⅱ组同期比较，拆方Ⅲ组评分低于拆方Ⅱ组(P<0.05)。

2.2 Western Blot检测结果 如图1、图2所示，各组方差齐性概率均>0.05，认为方差齐。其表达结果显示如下：假手术组与正常组表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。与假手术组及正常组同期比较，模型及各干预组蛋白表达均高于假手术组及正常组(P<0.05)。与灌胃1 d组比较，模型组及各干预组3、7d时p-JNK蛋白表达均有降低(P<0.05)。与灌胃3 d组比较，模型组及各干预组灌胃7d时p-JNK蛋白表达均有明显降低(P<0.05)。与模型组同期比较，各干预组p-JNK蛋白表达均低于模型组(P<0.05)。与失荅剌知丸组同期比较，各拆方组蛋白表达均高于失荅剌知丸组(P<0.05)。与拆方Ⅰ组比较，拆方Ⅱ、Ⅲ组p-JNK蛋白表达均低于拆方Ⅰ组(P<0.05)。与拆方Ⅱ组比较，拆方Ⅲp-JNK蛋白表达高于拆方Ⅱ组(P<0.05)。

组别n1d3d7d正常组617.59±0.417.53±0.2117.46±0.25假手术组617.23±0.3517.29±0.3717.31±0.20模型组64.74±0.80﹡8.02±0.94﹡9.65±1.23﹡失荅剌知丸组68.44±1.17﹡#11.86±1.14﹡#△14.55±0.71﹡#△▽拆方Ⅰ组66.53±0.88﹡#◇9.03±1.21﹡#△◇11.68±1.15﹡#△▽◇拆方Ⅱ组67.33±1.03﹡#◇10.64±0.54﹡#△◇13.84±0.62﹡#△▽◇拆方Ⅲ组67.09±0.83﹡#◇10.06±0.87﹡#△◇12.74±1.34﹡#△▽◇

注：与正常组及假手术组比较，*P<0.05;与模型组比较，#P<0.05;与灌胃1d比较，△P<0.05;与本组灌胃3d比较，▽P<0.05;与失荅剌知丸组比较，◇P<0.05。

3 讨论

缺血性卒中的病理基础以脑血流动力学的改变为主，随着年龄的增长以及各种老年病和血管疾病的发生，颅内外动脉变构[12]，血栓形成和栓子脱落的风险增加，从而导致了本病的发生。本病致残率极高，以神经功能缺损为主要表现[13]。本病治疗的关键是脑缺血后脑血流的恢复，但再灌注往往可加重脑缺血组织的损伤[14]，神经细胞缺血再灌注损伤导致JNK激活[15]，JNK通路对凋亡的调节至关重要[16]。JNK蛋白激酶有3个基因10种亚型，抑制其活化可降低脑组织的损伤[17]。失荅剌知丸出自《回回药方》残卷十二“众风门”篇，原方载“能开缠肠肚风病,最通经络”[18]，可知其以治疗脑中风经络不通所致口眼喎斜、半身不遂等症。且前期课题组研究已知该方高剂量组用于治疗缺血性中风时效果优于尼莫地平[5-7]，对其进一步的研究应用更值得探索。观察原方组成知其以化痰通络、芳香利湿为主，但因其药方中有多味不常用药，且其中巴豆、芦荟等用量较大，临床应用多有顾忌，故研究其组方特点进行本实验。

本实验研究结果表明，失荅剌知丸可明显降低大鼠脑损伤症状，改善大鼠神经功能，下调JNK蛋白表达，减低凋亡发生。其各拆方组中，以拆方Ⅱ组(即巴豆霜、柴胡、黑诃子、芦荟)表达结果最具优势，考虑该组药物可能为失荅剌知丸发挥治疗作用的主要药物组成，以君臣佐使配伍理论探讨该方组成，考虑该四味药物可能是该方的君药或君臣药。后期可对失荅剌知丸进一步探索，以探讨其治疗机制及组方原则。