槲皮素抑制人肝癌细胞HepG2的体内外活性研究

周孟，廖祥明，王珊，巩仔鹏，张荣红

恶性肿瘤是我国乃至全球最为主要的公共健康问题之一。调查发现，我国肿瘤总体5年生存率较低，仅为30.9%，与发达国家相比尚有明显差距［1］。槲皮素（Quercetin，Qu）属于黄酮类，广泛分布于多种蔬菜（洋葱、姜、芹菜等）、水果（苹果、草莓等）和中草药（银杏、三七、槐米等）中［2］。人体对Qu具有良好的耐受性，国际癌症研究机构已于1999将Qu归入对人无致癌性物质之列，可将Qu作为有益健康的食品补充剂使用［3］。Qu具有多种生物活性，如抗肿瘤、抗氧化、抗感染、免疫抑制、心血管保护和血糖调节等［4］。抗肿瘤活性方面，Qu可抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、干扰肿瘤细胞周期和信号转导通路、逆转肿瘤细胞多药耐药等作用［5-6］，对多种恶性肿瘤如肝癌、胃癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、卵巢癌及胆囊癌等均有较好抑制作用［7］。其中，以抗肝癌活性尤为显著，而原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，在我国近20年来其死亡率增加了41.17%，已成为我国第二位肿瘤病因。Qu可阻滞肝癌细胞周期，抑制肝癌细胞生长，具有显著的抗癌活性［8］，然而具体的抗肿瘤机制目前尚未完全明确［4］。并且，同时评价Qu体内外抗HepG2细胞活性及对凋亡的影响也未见报道。因此，本研究自2017年1月至2018年1月分别通过体外直接抑制HepG2细胞及体内抑制皮下移植肿瘤模型来考察Qu对肝癌细胞的抑制活性，并进一步分析了Qu对HepG2细胞凋亡的影响，为明确Qu的抗肝癌作用机制提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞与动物 人肝癌细胞株HepG2购置于美国ATCC，并由四川大学生物治疗国家重点实验室馈赠；雌性裸鼠（Balb/C nu/nu），4～6周龄，体质量18～20 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2015-0004；动物处置符合伦理学原则。

1.1.2试剂 Qu（100 mg，批号051K1225）购自Sigma公司；DMEM培养基、胎牛血清（FBS）均购自美国GIBCO公司；胰蛋白酶（trypsin）、注射用顺铂（Cisplatin）均购自云南个旧生物药业有限公司产品（批号150301），临用前用0.9%氯化钠溶液稀释；5%葡萄糖注射液购自太极集团西南药业股份有限公司产品（批号15081073）；氯化钠注射液（0.9%）购自四川科伦药业股份有限公司产品（批号M15062317）。体外用Qu用二甲基亚砜（DMSO）稀释成储存液冻存。使用时用DMEM培养基稀释成所需浓度，DMSO体积百分数＜0.1%；体内用Qu溶解在PEG400里，临用时用0.9%氯化钠溶液稀释成所需浓度。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 HepG2细胞常规培养于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM培养液中，置饱和湿度、37℃的5%CO2孵箱中培养。此细胞贴壁生长。

1.2.2细胞计数 体外培养的细胞经0.25%胰蛋白酶消化、吹打脱落并混匀后，用0.9%氯化钠溶液稀释到合适的密度。混匀后吸取少量悬液滴加到血球计数板上，在倒置显微镜下计数。记下4个大格的细胞总数，取平均数后乘以104，再乘以稀释倍数得到细胞密度，乘以总体积即得到细胞总数。

1.2.3MTT试验 取对数生长期细胞，消化液消化或直接吹打混匀后计数；调整细胞悬液浓度每毫升3×104，于96孔板中每孔加入100µL细胞悬液；24 h后吸掉原有培养基，分别加入200µL含有Qu的完全培养液（阴性对照组加等量DMSO），每组5孔，继续培养于CO2孵箱；分别于加药后24、48和72 h后取出96孔板，每孔加入5 mg/L MTT试剂20µL，继续培养4 h；吸出孔中的液体，每孔加入150µL DMSO，室温震荡15 min充分溶解沉淀，用酶标仪在570 nm波长检测每孔细胞OD值。

根据相对抑制率判断Qu对肿瘤细胞的抑制作用：

相对抑制率＝（对照孔平均OD值-加药孔平均OD值）÷对照孔平均OD值×100%。

1.2.4HepG2细胞裸鼠皮下移植模型的建立

HepG2细胞长到80%～90%汇合度时，用0.25%的胰酶消化后离心，加无血清培养基悬浮，用血球计数板对细胞进行计数。离心后用无血清漂洗一次，然后再次离心。去掉培养基后，加入合适体积的无血清DMEM培养基，将细胞浓度调节到每毫升108个细胞悬液，在注射之前置于冰上。混匀细胞悬液，用1 mL注射器往裸鼠右侧flank位置皮下注射100µL细胞悬液（107个细胞）。接种后一周左右，待肿瘤长到3 mm×3 mm时，进行随机分组。

1.2.5移植瘤种植及药物治疗 接种后待肿瘤直径长至6 mm以上时，淘汰肿瘤体积过大、过小的荷瘤裸鼠，将合格动物采用随机数字表法分组，实验设0.9%氯化钠溶液阴性对照组，腹腔注射给药Qu低（12.5 mg/kg）、中（25 mg/kg）、高剂量组（50 mg/kg），阳性药顺铂组（5 mg/kg），共5组，每组6只荷瘤裸鼠。分组后次日第一次给药，Qu组给药频率为每2 d腹腔注射给药一次；阳性药顺铂组（5 mg/kg）为每5 d腹腔注射给药。

1.2.6观察指标和有效判定标准 从分组当天开始，对小鼠体质量和肿瘤大小进行测量，并对可能存在的药物毒性进行观察。

（1）体质量测量：置于电子天平上测量，结果精确到0.1 g。同时观察毒性反应，治疗期间观察小鼠对药物的反应，如皮毛色泽、立毛反应、食欲及活跃程度等。

（2）肿瘤体积（TV）、相对肿瘤体积（RTV）和相对肿瘤增殖率：每2天用1/50 mm精度游标卡尺测肿瘤的长径和短径，动态观察受试药抗肿瘤的效应。TV的计算公式为：TV（mm3）＝a×b2×π/6

其中a、b分别表示长径和短径。根据测量的结果计算出RTV，计算公式为：RTV＝Vt/V0，其中V0为每一组在分笼给药时（即d0）测量所得TV，Vt为该组每一次测量时的TV。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增值率T/C（%），计算公式如下：

TRTV：治疗组相对肿瘤体积；CRTV：阴性对照组相对肿瘤体积。

疗效评价标准：T/C（%）＞60为无效；T/C（%）≤60，并经统计学处理P＜0.05为有效。

（3）肿瘤重量测定及抑瘤率（%）的计算：于治疗终点时处死动物，解剖剥离瘤块，称瘤重，并照像。按下式计算肿瘤生长抑制率：

有效判定标准：抑瘤率（即肿瘤生长抑制率）＜40%为无效；抑瘤率≥40%并经统计学处理P＜0.05为有效。

（4）综合判定标准：上述2项有效判定标准（相对肿瘤增殖率和抑瘤率）中，有一项符合有效标准判为有效。

1.3 统计学方法采用SPSS 17.0和GraphPad Prism 5软件对实验结果进行统计分析。各实验均独立重复3次。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外Qu对HepG2细胞增殖的影响为了测试Qu对肿瘤细胞HepG2的直接作用，实验中使用MTT法对比分析了不同浓度的Qu（0，10，20，40，80和160 µmol/L）在不同时间（24，48，和72 h）对体外肿瘤细胞HepG2增殖的影响（图1）。结果发现，随着检测时间的延长，Qu对HepG2的抑制活性也逐渐增强（图1A），24，48和72 h的IC50分别为110.50，63.73和46.38µmol/L（图1B），可见Qu对肝癌细胞的生长和增殖具有时间和浓度依乘抑制效果。

2.2 Qu对HepG2肝癌裸鼠皮下移植瘤的影响

2.2.1Qu对肿瘤体积与动物体质量的影响 通过测试不同浓度（12.5，25和50 mg/kg）的Qu对HepG2人肝癌裸鼠皮下移植瘤肿瘤体积的影响（图2A），发现Qu能够显著抑制HepG2在体内的增殖，且呈浓度依赖性。尤其是当Qu给药浓度为50 mg/kg时，在前12 d内其抑制活性较阳性药物顺铂更好；在第12～18天之间，活性与阳性药物顺铂相当。在动物体质量方面，各浓度Qu组的动物体质量与空白对照组几乎相同，而顺铂组体质量下降非常明显（图2B），在第20天体质量下降接近30%，并导致了其中一只实验动物的死亡。在第21天处死动物后，可以观察到顺铂组肿瘤体积显著受到抑制。各浓度的Qu组的肿瘤体积明显小于空白对照组（图3），并且随着Qu浓度的提升，肿瘤体积也相应减小，但相对于阳性药物顺铂抑瘤效果略差。

2.2.2Qu对RTV值的影响 经测量裸鼠瘤体积与第1天给药时瘤体积计算RTV值，结果见表1。可见，与0.9%氯化钠溶液组相比，Qu各剂量组和顺铂组均在第6至10天开始差异有统计学意义，HepG2肿瘤体积受到显著抑制，且Qu各剂量组比阳性药略好。第12至20天与0.9%氯化钠溶液阴性对照组相比，各实验组也显著抑制肿瘤增殖，并且50 mg/kg Qu活性与阳性组相当，而中、低剂量组活性稍差。

图1 不同检测时间（24，48，及72 h）下槲皮素对HepG 2细胞的抑制曲线（A）与IC50值（B）

图2 槲皮素对HepG2人肝癌皮下移植瘤肿瘤体积（A）与模型老鼠体质量（B）的影响

图3 腹腔注射不同药物后，第21天HepG2人肝癌裸鼠皮下肿瘤模型动物（A）与肿瘤（B）

2.2.3Qu对移植瘤肿瘤抑瘤率与相对增殖率的影响 进一步分析各组肿瘤的抑瘤率与肿瘤相对增值率可以发现，阳性药物顺铂对HepG2细胞裸鼠皮下肿瘤模型的抑瘤率为59.59%（表2），大于40%，与空白对照相比，差异有统计学意义；并且其相对肿瘤增殖率为38.07%（表3），小于60%，两组数据均表明顺铂对人肝癌HepG2细胞裸鼠皮下肿瘤具有明显的抑制作用。50 mg/kg Qu组对人肝癌HepG2细胞裸鼠皮下肿瘤模型的抑瘤率为46.65%，大于40%，差异有统计学意义；并且相对其肿瘤增殖率为46.68%，小于60%，两组数据均表明50 mg/kg的Qu对人肝癌HepG2细胞表现出较理想的抑制效果。25 mg/kg Qu对人肝癌HepG2细胞裸鼠皮下肿瘤模型的抑瘤率为40.23%，大于40%，差异有统计学意义；并且其相对肿瘤增殖率为52.58%，小于60%，两组数据也表明25 mg/kg的Qu在人肝癌HepG2细胞裸鼠皮下肿瘤模型上表现出一定抑制效果。然而12.5 mg/kg Qu对人肝癌HepG2细胞裸鼠皮下肿瘤模型的抑瘤率为11.22%，小于40%，差异有统计学意义；且其相对肿瘤增殖率为75.30%，大于60%，则表明12.5 mg/kg的Qu在人肝癌HepG2细胞裸鼠皮下肿瘤模型中抑制作用较弱。综上可知Qu在体内对HepG2肝癌的抑癌作用呈浓度依赖性，在中、高浓度表现较为显著的抑制作用，并且在高浓度（50 mg/kg）时与阳性药物顺铂活性相当。然而考虑到顺铂极为明显的毒副作用，几乎无毒性的Qu极具开发价值。

表1 各实验组裸鼠RTV值变化/±s

表1 各实验组裸鼠RTV值变化/±s

注：Qu为槲皮素；与0.9%氯化钠溶液组比较，aP＜0.05

组别0.9%氯化钠溶液组顺铂（5 mg/kg）Qu（50 mg/kg）Qu（25 mg/kg）Qu（12.5 mg/kg）与0.9%氯化钠溶液组比较P值顺铂（5 mg/kg）Qu（50 mg/kg）Qu（25 mg/kg）Qu（12.5 mg/kg）鼠数6 6 6 6 6 2 d 1.58±0.59 1.27±0.40 1.09±0.16 1.12±0.34 1.00±0.07 4 d 1.85±0.62 1.59±0.62 1.30±0.29 1.41±0.41 1.15±0.27 6 d 2.85±0.74 1.98±0.87 1.71±0.61a 1.85±0.48a 1.32±0.38a 8 d 3.29±1.02 2.05±0.79a 1.58±0.55a 2.20±0.80 1.81±0.56 10 d 4.38±0.62 2.25±0.76a 1.85±0.58a 2.58±0.55a 2.29±0.52a 12 d 5.08±0.36 2.17±0.57a 2.19±0.53a 2.79±0.63a 2.41±0.53a 14 d 5.81±0.52 2.67±1.02a 2.81±0.69a 3.50±0.65a 3.05±0.82a 16 d 6.30±0.58 2.54±0.96a 2.82±0.63a 3.47±0.48a 3.67±1.29a 18 d 8.13±2.16 3.10±0.46a 3.47±0.72a 4.11±0.55a 3.61±0.82a 20 d 8.58±0.73 3.26±0.93a 4.00±0.64a 4.51±0.77a 5.12±0.82a 0.000 0.000 0.001 0.003 0.650 0.810 0.760 0.920 0.770 0.650 0.850 0.560 0.060 0.045 0.049 0.039 0.045 0.028 0.037 0.032 0.016 0.013 0.025 0.022 0.001 0.002 0.009 0.008 0.002 0.007 0.012 0.009 0.000 0.000 0.005 0.005 0.000 0.000 0.001 0.000

表2 槲皮素（Qu）对人肝癌HepG2细胞裸鼠皮下移植瘤肿瘤瘤重的影响及抑瘤率

表3 各实验组裸鼠相对肿瘤增殖率［T/C（%）］

2.3 Qu对HepG2肝癌裸鼠皮下移植瘤细胞凋亡的影响采用原位末端标记（TUNEL）的方法检测HepG2移植瘤组织病理切片中细胞凋亡的情况，结果显示中剂量、高剂量和顺铂组的肿瘤细胞发生了明显的凋亡，空白对照组和低剂量组的肿瘤细胞只发生了极为少量的细胞凋亡。进一步分析HepG2细胞凋亡率发现，相对于阳性组25.73%的凋亡率，50 mg/kg的Qu也能使其凋亡率达到20.17%（图4），且与0.9%氯化钠溶液组相比差异有统计学意义（P＜0.001，表4）。

图4 不同浓度的槲皮素与顺铂对HepG2细胞凋亡的影响

表4 各实验组细胞凋亡统计值比较

3 讨论

Qu是植物界中含量最丰富的黄酮类化合物之一，广泛存在于各种蔬菜、水果以及中草药中。Qu可通过多种途径发挥抗肿瘤作用，且由于其较高的安全性，使Qu的抗肝癌活性已成为国内外研究的热点之一［9-10］。本研究首先通过体外直接抑制实验，发现Qu对HepG2细胞具有明显的抑制活性，并且随着检测时间的延长，抑瘤活性增加，其IC50值由24 h的110.50µmol/L降低至72 h的46.38µmol/L，具有显著的时间与浓度依乘效果。通过对Balb/C裸鼠（nu/nu）皮下移植瘤的抑制实验发现，Qu能够浓度依赖性的抑制移植瘤的生长，其中50 mg/kg的Qu在前12 d内其抑制活性较阳性药物顺铂更好。在HepG2移植瘤肿瘤瘤重方面，25和50 mg/kg的Qu都能显著减小瘤重，且50 mg/kg的Qu抑制作用与阳性药顺铂弱相当，但由于顺铂的毒性，导致给药后期实验动物的体质量降低近30%，甚至导致实验动物死亡。同时，可能由于阳性组实验动物本身体质量下降严重，营养供应不足导致肿瘤细胞生长受到抑制，而表现出较为显著的抑制活性。相比之下，Qu各剂量组动物体质量与对照组相比无明显变化，表明其几乎无毒性，且中、高剂量（25和50 mg/kg）的Qu还能显著提升HepG2的凋亡。综上所述，良好的抗肿瘤活性、极低的药物毒性以及庞大的自然储备，使得Qu极具研究开发的潜能。