超高效合相色谱法对6种三唑类农药对映体的拆分及其在黄瓜中的残留分析

张文华, 谢 文*, 侯建波, 陈钦可, 李淑敏, 祝泽龙, 邹学权, 徐敦明

(1.浙江省检验检疫科学技术研究院, 浙江 杭州 310016; 2.浙江立德产品技术有限公司, 浙江 杭州 310016; 3.厦门海关技术中心, 福建 厦门 361026)

手性是自然界普遍存在的现象,随着科学的发展,对光学纯物质的需求量越来越大,手性对映体分离日益引起人们的关注。传统的手性农药研究,不区分对映体,将所有对映体视为同一物质来对待,GB 2763-2016《食品中农药最大残留限量》中只是规范了农药的外消旋体使用安全标准,并未精确规定每种农药的有功效且低毒性的对映体和无功效且高毒性的对映体残留限量。然而,手性农药的不同对映体在生物过程及环境介质中,往往存在着立体选择性行为。如三唑醇有2个手性中心,因此有4个对映异构体,这4个光学异构体杀菌能力完全不同,左旋体的药效高于右旋体,毒性还比右旋体低[1]。而GB 2763-2016规定茄果类蔬菜中三唑醇的最高残留限量≤1.0 mg/kg,如果能进一步研究三唑醇的4种对映体在蔬菜水果中的残留量,那将能为三唑醇对映体残留分析提供精确的判定。

三唑类农药作为一类高效杀菌剂,能有效保护水果、大豆、谷物等农作物免受细菌侵害,在农业生产中的应用非常广泛[2]。该类化合物分子中均含有1个或2个手性中心,即存在2个或4个对映体结构。目前三唑类农药手性分离主要是通过色谱方法实现的,如电泳(CE)[3-7]、气相色谱法(GC)[8,9]、高效液相色谱法(HPLC)[10-12]和超临界流体色谱法(SFC)[1,13]等均有成功拆分的研究报道。对映体的物理化学性质相似,传统手段拆分较为困难。所需拆分时间通常在30 min以上,可能需要几根手性柱配合使用,有些对映体拆分效果不理想。近年来新推出的超高效合相色谱(UPC2)的流动相为压缩二氧化碳,是一种介于气体和液体之间的超临界流体,流体黏度小,比HPLC中所使用的液体流动相扩散率更高、更有利于传质。同时,所使用的手性色谱柱是基于亚2 μm粒径填料的色谱柱,粒径小,理论塔板数高,分离效率高。温度和压力的微小变化能引起UPC2流动相的密度和溶解能力的较大差异,通过精确地调节流动相强度、压力和温度获得所需要的系统分辨率和选择性,从而对待测物的保留和分离进行有效调控。这非常适合结构类似物、异构体以及对映体和非对映体的分离、检测和定量[14-16]。目前,UPC2技术应用于三唑类农药对映体的分离和相应对映体的残留测定鲜有报道。

为了解决上述对映体拆分测定的难题,本文建立了一种超高效合相色谱法拆分三唑酮、三唑醇、己唑醇、戊唑醇、联苯三唑醇、腈菌唑6种三唑类农药对映体及测定其对映体在黄瓜基质中残留量的方法。方法的回收率和精密度均符合残留检测的要求。对药物的使用效果、残留量判定和新药开发有重要的指导意义。

1 实验部分

1.1 仪器、材料与试剂

超高效合相色谱仪(美国沃特世公司);台式离心机(美国Thermo公司); R215旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司); AE260电子天平(瑞士Mettler公司); MS2涡旋混匀器(上海医大仪器厂);超纯水净化系统(英国Elga公司);微孔过滤膜(0.22 μm,有机相);氮吹仪(日本东京理化公司)。

正己烷、丙酮、乙腈(色谱纯,西班牙Scharlau公司);无水硫酸钠(分析纯,450 ℃灼烧,上海试四赫维化工有限公司);弗罗里硅土(Florisil)吸附剂(优级纯,100～200目,国药集团化学试剂有限公司,650 ℃灼烧24 h, 使用2%超纯水灭活后备用);石墨化炭黑(GCB)、N-丙基乙二胺(PSA)和C18(优级纯,上海安谱科学仪器有限公司);无水硫酸镁(分析纯,西陇科学股份有限公司); QuEChERS试剂(含有PSA 50 mg、C18 50 mg、GCB 7.5 mg、无水硫酸镁150 mg);水为超纯水;其他实验所用试剂除特殊说明外均为分析纯。

6种外消旋体:三唑酮、三唑醇、己唑醇、戊唑醇、联苯三唑醇、腈菌唑(纯度≥99%,德国Dr Ehrenstorfer 公司)。

16种对映体:(+)-S-三唑酮、(-)-R-三唑酮、(-)-(S,R)-三唑醇、(+)-(R,S)-三唑醇、(-)-(S,S)-三唑醇、(+)-(R,R)-三唑醇、(+)-己唑醇、(-)-己唑醇、(+)-S-戊唑醇、(-)-R-戊唑醇、(-)-联苯三唑醇-A、(+)-联苯三唑醇-A、(-)-联苯三唑醇-B、(+)-联苯三唑醇-B、(+)-腈菌唑、(-)-腈菌唑(纯度均大于95.0%,上海勤路生物技术有限公司)。

1.2 标准溶液及试剂配制

1.2.1外消旋体标准溶液

6种三唑类农药储备液(1.0 g/L):分别称取0.01 g(精确至0.1 mg)上述三唑类农药外消旋体标准品,用正庚烷分别溶解定容至10 mL, 4 ℃避光保存。

标准中间溶液:分别准确量取适量的三唑酮、三唑醇、己唑醇、戊唑醇、联苯三唑醇、腈菌唑外消旋体标准储备液,依次用正庚烷稀释配制成6组20.0 mg/L的外消旋体标准溶液(用于后续外消旋体的拆分), 4 ℃避光保存。

1.2.2对映体标准溶液

16种三唑类农药对映体储备液(1.0 g/L):分别称取0.01 g(精确至0.1 mg)上述三唑类农药对映体标准品,用正庚烷分别溶解定容至10 mL, 4 ℃避光保存。

分别准确量取适量的对映体储备液,依次用正庚烷稀释配制成16种20.0 mg/L的对映体标准溶液(用于确定16种对映体的保留时间), 4 ℃避光保存。

标准中间溶液:分别准确量取几种适量的对映体储备液,混合,用正庚烷稀释配制成100.0 mg/L的标准中间溶液,于4 ℃避光保存。标准中间溶液共4组,如下:A组包括(+)-S-三唑酮、(-)-R-三唑酮、(+)-S-戊唑醇、(-)-R-戊唑醇、(-)-联苯三唑醇-A、(+)-联苯三唑醇-A、(-)-联苯三唑醇-B和(+)-联苯三唑醇-B共8种对映体;B组包括(-)-(S,R)-三唑醇、(+)-(R,S)-三唑醇、(-)-(S,S)-三唑醇、(+)-(R,R)-三唑醇共4种对映体;C组包括(+)-己唑醇和(-)-己唑醇2种对映体;D组包括(+)-腈菌唑和(-)-腈菌唑2种对映体。

标准工作溶液(用于黄瓜样品残留实验分析):准确吸取一定量的标准中间溶液A、B、C、D,用乙腈分别稀释至0、1.0、2.0、4.0、10 mg/L的标准工作溶液A、B、C、D, 4 ℃避光保存。

1.3 样品前处理

1.3.1样品提取

称取试样10 g(精确至0.01 g)于50 mL离心管中,加入20 mL乙腈,均质提取,再加入3.0 g氯化钠,涡旋混匀,4 000 r/min离心5 min后,移取上清液至盛有0.5 g石墨化炭黑的50 mL离心管中,涡旋1 min后,以8 500 r/min离心5 min,转移上清液至浓缩瓶中,向剩余残渣中再加入20 mL乙腈重复上述提取步骤,合并两次提取液,用旋转蒸发仪浓缩至近干,用50 mL丙酮-正己烷(1∶1, v/v)溶液复溶。

1.3.2净化

将复溶液转移至装有10 g脱活弗罗里硅土玻璃管中(使用前已做过淋洗曲线),上样后用浓缩瓶直接接收净化液,用旋转蒸发仪浓缩至近干,用1 mL乙腈定容,定容液用QuEChERS试剂净化,15 000 r/min离心5 min后,经0.22 μm混合型滤膜过滤作为测定液。

1.4 色谱条件

色谱柱:Acquity Trefoil AMY1 (150 mm×3.0 mm, 2.5 μm,填料为改良的多糖型手性固定相,美国Waters公司);助溶剂:甲醇(三唑酮、三唑醇、戊唑醇、联苯三唑醇),异丙醇-无水乙醇(1∶1, v/v)溶液(己唑醇、腈菌唑);动态备压(ABPR): 17.2 MPa;流速:2.5 mL/min;进样量:10 μL;柱温:40 ℃;检测波长:250 nm(联苯三唑醇), 220 nm(其他5个化合物)。

1.2.2节中的4组对映体标准工作溶液A、B、C、D按照各自优化的色谱条件和未知样品的定容液一起进样测定。

2 结果与讨论

除三唑醇和联苯三唑醇有两个手性中心、4个对映体外,其他4种农药都只有1个手性中心、2个对映异构体。考虑到6种农药结构上具有一定的相似性,本实验尝试用一根手性柱(Acquity Trefoil AMY1)在UPC2上拆分这6种农药。

2.1 稳定性和定容液试剂的考察

将三唑类农药溶解于正庚烷中,配成1.0 g/L标准品溶液,于-18 ℃下保存放置。考察刚配制时所测得的农药含量和分别储存1、3、5、7、14、30、60天后的农药含量。结果显示,6种三唑类农药外消旋体于-18 ℃下放置14天时含量变化均小于10%,放置30天时含量降低了13%～42%,放置60天时含量降低了20%～67%,说明6种三唑类农药的外消旋体在14天内比较稳定(见图1)。6种三唑类农药对映体含量都是呈逐渐降低趋势,其中三唑醇的一个对映体(-)-(S,S)-三唑醇和戊唑醇的一个对映体(-)-R-戊唑醇于-18 ℃下放置14天时含量降低了10%以上,而放置7天时含量变化小于10%,其他对映体于-18 ℃下放置14天时含量变化均小于10%,说明6种三唑类农药的对映体在7天内比较稳定。

图1 6种三唑类农药外消旋体储备液在正庚烷中60天内的稳定性考察

实验前处理过程中样品浓缩10倍,杂质含量很高,对净化条件要求很高,因此实验中除了经过自制弗罗里硅土柱净化之外,定容液还要加QuEChERS试剂进行净化。标准工作溶液和定容液采用正庚烷试剂溶解,实验结果表明,定容液加QuEChERS试剂净化后,三唑醇对映体几乎被全部吸附,三唑酮的两个对映体分别被吸附了74%和79%,戊唑醇、联苯三唑醇和己唑醇的对映体分别被吸附了11%～36%,而采用乙腈试剂定容溶解,定容液加QuEChERS试剂净化后,这6种三唑类对映体被吸附量均小于5%,说明目标化合物在乙腈环境下几乎不会被吸附。虽然在正庚烷试剂中6种三唑类农药的对映体峰形更好,但是为了避免目标化合物被QuEChERS试剂吸附,故最终标准工作溶液和定容液均采用乙腈试剂。同时,本实验按照上述方法考察了6种三唑类农药外消旋体和对映体的工作溶液在乙腈中的稳定性,结果表明,标准工作溶液在乙腈中可以保存7天。

2.2 色谱条件的优化

UPC2所采用的流动相是以二氧化碳超临界流体为主体,配比不同有机溶剂作为助溶剂来调节流动相的极性和溶解性,有效改变目标物的峰形和保留时间,以获得最佳的分离效果,常用的助溶剂通常为甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇等。在其他色谱条件不变的情况下,考察流动相分别选择甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇为有机改性剂时对6种三唑类农药手性分离的影响。结果显示,以甲醇作为有机改性剂时,三唑酮、戊唑醇、联苯三唑醇和三唑醇对映体均达到良好拆分,己唑醇和腈菌唑的对映体无法达到良好的分离。而以异丙醇-乙醇为有机改性剂时,己唑醇和腈菌唑对映体均达到良好拆分。因此,针对该6种三唑类农药对映体的手性拆分,本实验采用了两种助溶剂,三唑酮、戊唑醇、联苯三唑醇和三唑醇采用甲醇作为助溶剂,己唑醇和腈菌唑采用异丙醇-乙醇作为助溶剂。

超高效合相色谱中,动态背压也是影响分离过程的重要因素之一,其主要作用是控制CO2在整个操作过程中处于超临界流体状态。在不同的动态背压下,CO2超临界流体对样品有着不同的溶解能力。当背压升高时,超临界流体密度会增大,溶剂化能力增强,柱压升高。本实验以CO2和甲醇或异丙醇-乙醇为流动相,考察背压在10.3～17.2 MPa范围内时对样品分离的影响。结果显示,随着动态背压升高,分析物保留时间减少。综合考虑保留时间、峰形及色谱柱压力,实验选择动态背压为17.2 MPa。

随着色谱柱温度的升高,目标物的保留时间逐渐延长,这与传统超高效液相色谱是不相同的。这是因为色谱柱温度越高,超临界流体密度越小,溶剂化能力降低,超临界流体对目标化合物的溶解及交换能力可能减弱,使得目标物的保留时间增大。本实验在保持其他色谱条件不变的前提下,在30～45 ℃范围内考察了柱温对目标物分离的影响。结果显示,三唑酮和己唑醇的最佳分离温度为35 ℃,戊唑醇的最佳分离温度为45 ℃,三唑醇、联苯三唑醇和腈菌唑的最佳分离温度为40 ℃,综合考虑6种三唑类农药16个对映体的分离效果及峰形,本实验柱温选择40 ℃。

综合比较了改性剂、动态背压、温度等影响因素,发现流动相中改性剂种类对6种三唑类农药对映体的分离效果影响最大,因此,选择适当改性剂及其配比是获得对映体最佳分离效果的主要手段。16种三唑类农药对映体标准溶液(1.2.2节中配制的20.0 mg/L)依次单独进样,按照上述优化的色谱条件分析,确定16种对映体的保留时间,并建立16种对映体标准品光谱库。6种三唑类农药外消旋体标准溶液(1.2.1节中配制的20.0 mg/L)依次单独进样,按照上述优化的色谱条件进行拆分,如图2所示,6种三唑类农药外消旋体的16个对映体均得到良好的分离。

图2 6种三唑类农药对映体的拆分色谱图

2.3 提取试剂的优化

文献报道中通常采用乙腈-丙酮[17]、丙酮-二氯甲烷[18]、丙酮-乙酸乙酯-正己烷[19]、乙腈[20,21]对三唑类农药进行提取,本文考察了这4种试剂的提取效果,结果显示用乙腈-丙酮或丙酮-乙酸乙酯-正己烷提取时,三唑酮、三唑醇、己唑醇和腈菌唑存在基质干扰峰;用丙酮-二氯甲烷提取时,6种三唑类农药的色谱图均存在基质干扰峰;而用乙腈作为提取试剂,6种三唑类农药的色谱图上的基质干扰峰较少,结果与文献报道的相符[20,21]。此外乙腈也是我国目前农药多残留分析方法常用的提取溶剂[22],因此本方法选其作为提取溶剂。

2.4 净化条件的优化

分别选用自制Florisil柱(10 g)、商品化Florisil柱(CNW, 5 g, 60 mL)、商品化Carb/NH2(艾杰尔,500 mg, 6 mL)3种固相萃取柱对黄瓜样品提取溶液进行净化试验,外标法定量。在3份空白黄瓜样品中分别添加0.1 mg/kg的三唑类农药对映体,用乙腈均质提取2次,提取液经过GCB净化,再分别采用3个不同固相萃取柱进行净化,消除黄瓜本底对实验结果的影响。实验结果表明:3种固相萃取柱均能有效去除色素成分,用Carb/NH2复合柱净化时,(-)-R-三唑酮、(+)-S-戊唑醇、(-)-R-戊唑醇、(-)-(S,S)-三唑醇和(+)-腈菌唑存在基质干扰峰,无法进行准确定量测定。而采用商品化Florisil柱和自制Florisil柱净化时,16个对映体的基质干扰较小,且平均回收率分别为85%和92%。Florisil柱需要加水脱活,自制Florisil柱比较容易控制弗罗里硅土的含水量,而商品化Florisil柱的弗罗里硅土是在包装内,每个柱子内的弗罗里硅土含水量不同,从而导致活性不一致,在对有些活性要求高的化合物检测时,样品检测的重现性较差。另外,市场上销售的Florisil柱规格大多是1 g、2 g或5 g,而10 g规格的Florisil柱较少,而本实验前处理过程中黄瓜样品浓缩10倍,杂质含量很高,1 g、2 g或5 g规格的商品化Florisil柱的柱容量达不到净化要求,因此必须使用10 g规格的Florisil柱。综合考虑,最终采用自制10 g Florisil柱净化黄瓜样品提取液。

2.5 方法学考察

2.5.1方法的线性范围和定量限

将16种三唑类农药对映体储备液用乙腈稀释成0、1.0、2.0、4.0、10 mg/L的标准工作溶液。在建立的分析条件下对其进行测定,以峰面积(y)对质量浓度(x)做标准曲线。结果表明,16种三唑类农药对映体在0～10 mg/L范围均呈良好的线性关系,相关系数为0.999。当空白黄瓜中添加0.1 mg/kg的三唑类农药对映体标准溶液时,信噪比大于10,因此方法的定量限(LOQ)被定为0.1 mg/kg,而欧盟、日本、国际食品法典委员会(CAC)规定该6种三唑类农药在黄瓜中的限量为0.1～1 mg/kg。本方法的定量限完全能满足黄瓜中三唑类农药对映体的测定要求。

2.5.2回收率和精密度

分别在空白黄瓜中添加0.1、0.2、0.5 mg/kg 3种水平的三唑类农药对映体进行方法学考察,按优化条件进行提取并分析,每个添加水平平行测定6次。如表1所示,6种三唑类农药中16个对映体的加标回收率在65.1%～116%之间,相对标准偏差(RSD)为1.0%～9.6%。(+)-S-三唑酮、(+)-联苯三唑醇-A、(-)-联苯三唑醇-B、(+)-腈菌唑和(-)-腈菌唑的加标回收率符合SN/T 0001-2016[23]对回收率的要求,其他11个对映体的加标回收率不符合SN/T 0001-2016[23]对回收率的要求。虽然部分三唑类农药对映体的加标回收率不符合SN/T 0001-2016[23]对回收率的要求,但其相对标准偏差小,重现性均较好。

2.6 实际样品检测

从当地超市、农贸市场上采购20批次黄瓜样品,涵盖本地产的大黄瓜和荷兰小黄瓜两个品种,利用所建立方法进行检测。结果显示,20批次黄瓜样品均未检出上述16种三唑类农药对映体。

表16种三唑类农药中16个对映体在黄瓜基质中的加标回收率及相对标准偏差(n=6)

Table1Spiked recoveries and relative standard deviations(RSDs)of16enantiomers of the six triazole pesticides in cucumber matrix(n=6)

PesticideenantiomerSpiked/(mg/kg)Recovery/%RSD/%(+)-S-Triadimefon0.181.3-92.86.60.286.9-93.84.20.587.8-98.25.7(-)-R-Triadimefon0.174.0-82.96.10.272.7-80.04.80.575.6-79.82.7(-)-(S,R)-Triadimenol0.176.6-85.25.60.274.7-89.49.40.574.4-78.62.8(+)-(R,S)-Triadimenol0.165.2-74.06.30.265.2-70.04.00.565.2-69.83.6(-)-(S,S)-Triadimenol0.169.8-83.09.30.269.1-79.87.40.571.0-80.06.4(+)-(R,R)-Triadime-nol0.168.5-79.37.60.271.6-78.44.60.571.6-75.22.5(+)-Hexaconazole0.196.0-1096.60.299.5-1167.90.595.6-1087.0(-)-Hexaconazole0.175.1-89.09.00.278.4-93.28.70.575.2-78.42.1(+)-S-Tebuconazole0.165.1-77.49.30.267.6-75.85.80.592.4-99.63.9(-)-R-Tebuconazole0.180.2-91.06.90.281.8-97.28.70.577.2-81.82.9(-)-Bitertanol-A0.173.4-87.59.60.275.8-88.37.60.575.8-79.42.4(+)-Bitertanol-A0.189.3-99.45.40.293.7-99.43.30.597.2-1053.8(-)-Bitertanol-B0.181.7-94.87.60.294.5-99.83.10.590.2-94.82.8(+)-Bitertanol-B0.175.5-84.85.80.279.6-95.59.40.575.8-79.62.6(+)-Myclobutanil0.192.9-1045.80.294.4-1045.30.598.4-1043.2(-)-Myclobutanil0.182.4-90.45.00.289.2-98.04.70.587.4-89.21.0

3 结论

通过对影响超高效合相色谱分离分析的主要因素进行优化,建立了超高效合相色谱法拆分6种三唑类农药对映体的方法,以及检测黄瓜中的6种三唑类农药对映体残留的分析方法。该方法为深入分析农产品 中具有功效且低毒性的对映体和无功效且高毒性的农药对映体残留提供了参考，对药物的质量控制及药效评价具有重要的意义