不同干燥方式对蛋清粉蛋白质凝胶特性及结构的影响

代晓凝，刘丽莉*，陈珂，李媛媛，郝威铭，杨晓盼

1(河南科技大学 食品与生物工程学院，河南 洛阳,471023) 2(食品加工与安全国家级教学示范中心(河南科技大学)，河南 洛阳，471023)

蛋清粉来源丰富，储存运输方便，具有较好的保藏性能，是一种优质蛋白资源，被广泛应用于食品行业。随着食品工业的迅速发展，蛋清粉的应用领域不断扩大，对专用功能性蛋清粉的要求也更为严格[1]。鸡蛋清粉的凝胶特性是其重要的功能特性之一，工业上常利用此特性生产火腿肠、鱼糜等食品。然而我国对蛋清粉凝胶特性的研究较为落后，因此高凝胶型蛋清粉的研发已迫在眉睫。在鸡蛋清粉的生产加工过程中，干燥方式是影响蛋清粉功能特性的重要因素之一。因此采用适当的干燥方式对鸡蛋清进行干燥处理，开发出具有更高凝胶特性的蛋清粉，对于拓展其应用领域具有非常重要的市场价值。

目前，已有很多国内外学者对蛋粉进行研究。刘静波等[2]、赵媛等[3]对比研究了多种干燥方式所得全蛋粉的冲调特性，结果表明，喷雾干燥所得全蛋粉冲调性能最高，为生产具有良好冲调性蛋粉提供了理论指导。沈青等[4]对比研究喷雾干燥和真空冷冻干燥所得全蛋粉的理化性质和功能性质，结果表明，真空冷冻干燥全蛋粉的溶解度、起泡性及乳化性均高于喷雾干燥。陶汝青等[5]采用不同的温度和时间对大豆分离蛋白进行处理，得出在热处理温度90 ℃、15 min，并保温30 min的条件下制备大豆分离蛋白凝胶的效果最佳。AYADI等[6]研究了喷雾干燥温度对蛋清蛋白凝胶特性的影响，结果表明，进口温度在110～125 ℃范围内，随温度的升高凝胶强度也逐渐增强。SREENIVASULA等[7]研究发现射频处理标准蛋清粉，不会影响其色泽和溶解度，但可以提高其起泡性和凝胶特性。KATEKHONG等[8]研究了喷雾干燥温度对蛋清粉的物理性能、溶解度和胶凝性能的影响，并确定了样品的储存稳定性与温度和时间的关系，为蛋白粉的生产和储存提供了依据。JUNHUA等[9]研究发现碱或盐诱导的鸡蛋清体系的流变学特性与凝胶特性、表面疏水性、分子表面电荷和蛋白质二级结构的变化密切相关。ZHOU等[10]采用冷冻干燥与微波真空干燥结合的方式干燥鸭蛋，可以明显缩短干燥时间，且生产质量与真空冷冻干燥得到的鸭蛋粉类似。SU等[11]研究了不同共混比和蛋白浓度的大豆蛋白分离蛋白/蛋清蛋白复合凝胶的凝胶性质和二级结构，确定了最佳凝胶特性的蛋白比例。

目前，前人已比较分析了不同干燥方法对全蛋粉冲调性能、起泡性、乳化性的影响，对于蛋清粉的改性也已有报道[12]，但有关不同干燥方式对蛋清粉蛋白结构特性及凝胶形成机理影响方面的研究还少有报道，因此，本试验采用热风干燥法(hot air drying，HD)、喷雾干燥法(spray drying，SD)和冷冻干燥法(freeze drying，FD)对鸡蛋清进行干燥处理，探究干燥方式对鸡蛋清粉蛋白质的凝胶特性和结构特性的影响，以期为蛋白质改性提供基础研究，找出有效提高蛋白质凝胶特性的方法，为鸡蛋清粉的深加工及应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜鸡蛋,河南省洛阳市大张超市；KBr(分析纯)，天津市光复经济化工研究所；KOH(分析纯)，广东西陇化工试剂厂；DTNB(分析纯)，洛阳试剂厂；戊二醛(分析纯)，天津中信凯泰有限公司；叔丁醇(分析纯)，上海利博化工实业有限公司。

1.2 仪器与设备

TF-FD-27S真空冷冻干燥机，上海田枫实业有限公司；OM-1500喷雾干燥机，上海顺仪实验设备有限公司；101A-4电热恒温鼓风干燥箱，南京华奥干燥设备有限公司；SMS TA.XT Epress Enhanced食品物性分析仪，英国SMS公司；Cary eclpise荧光分光光度计，美国Aglient Cary elipse公司；UV2600紫外分光光度仪，日本日立公司；Q200差示扫描量热仪，瑞士Mettler-Toledo公司；TM3030Plus电子扫描显微镜，日本岛津公司；VERTEX70傅里叶红外光谱仪，德国Bruker公司。

1.3 实验方法

1.3.1 鸡蛋清粉的制备

参照刘静波等[2]的方法制备蛋清粉研究的基础上，在保证不影响蛋粉感官及营养品质的条件下设定干燥参数。

真空冷冻工艺流程：

鲜蛋→打蛋→分离蛋清→搅拌、过滤→自然发酵(48 h)→预冻(-20 ℃，2 h)→冷冻干燥(压力15 MPa，温度-60 ℃，24 h)→过筛→包装

喷雾干燥工艺流程：

鲜蛋→打蛋→分离蛋清→搅拌、过滤→自然发酵(48 h)→喷雾干燥(进风温度170 ℃，出风温度 80 ℃)→过筛→包装

热风干燥工艺流程：

鲜蛋→打蛋→分离蛋清→搅拌、过滤→自然发酵(48 h)→热风干燥(物料厚度4 mm，温度60 ℃)→过筛→包装

1.3.2 鸡蛋清凝胶的制备

用蒸馏水将蛋清粉稀释成质量浓度100 g/L的溶液，搅匀后，倒入25 mL的烧杯中于80 ℃加热45 min，取出后在4 ℃的冰箱中冷藏过夜即得凝胶。

1.3.3 鸡蛋清粉凝胶特性分析

1.3.3.1 凝胶强度特性分析

根据HUANG等[13]的方法测定凝胶强度。将制备的凝胶取出，在室温下放置20 min后，采用TPA模式，P/0.5的探头测定凝胶强度(g)。测试速度设为：测前5 mm/s，测中2 mm/s，测后2 mm/s，触发力设为3 g。

1.3.3.2 凝胶失水率分析

取一定质量的凝胶，切成大小均一的小粒，10 000 r/min离心10 min，取出并吸干凝胶表面水分、称重，凝胶失水率按照公式(1)计算：

(1)

式中：m0，待测凝胶质量，g；m1，离心后凝胶质量，g。

1.3.4 色差分析

将蛋清粉凝胶用色差分析仪进行色度测量，采集L*(明度)、a*(红度)、b*(黄度)，与白色标板进行比较，分析色差的变化。每个样品测量值取3次测量的平均值。

1.3.5 干燥处理后蛋清蛋白的结构与理化性质分析

1.3.5.1 巯基含量分析

根据LIU等[14]的方法测定鸡蛋清粉凝胶样品的总巯基及表面巯基含量。总巯基含量测定：将蛋清粉用PBS缓冲液配制成2 mg/mL(质量浓度)的溶液，取0.5 mL加入到2 mL缓冲液(8%SDS、8 mol/L尿素、0.1 mol/L PBS，pH 7.4)中，并加入 50 μL 10 mmol/L Ellman试剂(pH 7.4)，混匀后静置20 min，在412 nm处测得吸光度A412；表面巯基含量的测定：取50 μL的Ellman试剂加入到蛋清溶液(0.5 mg/mL，2.5 mL)混匀后静置 25 min，于 412 nm下测定吸光度。巯基含量按公式(2)计算:

(2)

式中：D，稀释倍数;ρ，溶液最终质量浓度，mg/mL。

1.3.5.2 表面疏水性分析

根据CHELH等[15]的方法并稍作修改：将3种鸡蛋清粉溶于Tris-HCl缓冲液(0.1 mol/L，pH 7.4)制成2.5 mg/mL(质量浓度)的溶液；吸取1 mL待测液和200 μL、1 mg/mL的溴酚蓝(BPB)溶液置于10 mL离心管中，混匀后，离心15 min(10 000 r/min)，取上清液稀释10倍并于595 nm处测得吸光度A1，以Tris-HCl缓冲液替代样品溶液，其他操作一致，作为对照，测定其吸光度A0。表面疏水性按公式(3)计算：

(3)

式中：BPB，溴酚蓝结合量，%；A0，以Tris-HCl缓冲液为对照时测定的吸光值；A1，上清液稀释10倍后测定的吸光值。

1.3.6 傅里叶红外光谱(fourier transform infrared, FT-IR)分析

将处理后的蛋清粉样品与KBr混匀后，进行手动压片，用FT-IR仪进行扫描。分辨率设为4 cm-1，4 000～400 cm-1进行扫描，用Peak Fit v4.12软件对红外光谱的酰胺Ⅰ带进行去卷积处理和二阶导数拟合。

1.3.7 差示扫描热量(differential scanning calorimetry, DSC)分析

使用DSC法测定干燥处理后的蛋清蛋白变性温度。称取6～8 mg蛋清粉样品于坩锅中，以空坩锅作为对照，测试参数：氮气流速设定20 mL/min，升温速率设定10 ℃/min，并在20～150 ℃扫描得到曲线。

1.3.8 荧光光谱(FS)分析

将3种鸡蛋清粉样品溶于Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液，配成0.5 mg/mL(质量浓度)的蛋白溶液，分别放入荧光分光光度计。激发波长为295 nm，扫描波长为300～450 nm进行扫描。

1.3.9 扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM)分析

将凝胶切成薄片状，用戊二醛(体积分数2.5%)固定5 h以上，并用pH 7.4的磷酸缓冲液洗涤3次，单次15 min。然后用体积分数60%(2次)、70%、80%(2次)、90%、100%乙醇梯度脱水，单次15 min。样品用叔丁醇浸泡置换乙醇，采用真空冷冻干燥对凝胶样品进行干燥处理。喷金后，用扫描电镜观察凝胶样品。

1.4 数据处理

试验所涉及到的测定结果均做3次重复，数据用Origin 9.0软件作图，用SPSS软件进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 鸡蛋清粉凝胶特性分析

影响蛋清凝胶性的原因主要是蛋清蛋白的变性和聚集程度。由图1可知,3种干燥方式蛋清粉凝胶硬度差异显著(P<0.05)，SD和HD蛋清粉的凝胶硬度比FD分别提高了49.47%、23.87%；其原因可能是干燥温度越高，蛋白质变性程度越大，发生分子间聚集有利于形成规则的蛋白质网络结构，从而有助于蛋清粉凝胶性能的提高。HD干燥温度较低不能更好地形成蛋白网络结构，且HD蛋清粉溶解度差,导致蛋粉凝胶硬度小于SD蛋清粉[2]。陶汝青等[5]的研究表明在一定温度范围内，蛋白质凝胶强度随温度上升而增加，与本研究结果一致。失水率为SD(27.4%)

图1 干燥方式对鸡蛋清粉凝胶硬度及凝胶失水率的影响Fig.1 Effect of drying method on gel hardness and gel water loss rate of egg white powder注：不同字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

2.2 鸡蛋清粉凝胶色差分析

色泽是食品感官评价的一个重要指标，直接影响产品外观，由表1可知，3种凝胶有着一定的差异。从蛋清粉的L*值(明度)可以看出FD>HD>SD(P<0.05)；SD和HD蛋粉凝胶的a*值(红度)和b*值(黄度)均显著高于FD，表明SD与HD蛋粉凝胶颜色更深，这种颜色上的差别是由于不同的干燥方式制得的蛋白粉颗粒形态、大小以及表面结构不同造成的，另一原因可能是干燥方式不同使样品发生不同程度的美拉德反应所致[16]。蛋清液经自然脱糖后仍有少量葡萄糖存在，干燥温度越高，美拉德反应速率越快，因此SD比HD蛋清凝胶的颜色稍深[17]，美拉德反应的发生能够在一定程度上提高凝胶硬度，这也是SD蛋清凝胶硬度较大的原因。

表1 干燥方式对鸡蛋清粉凝胶色泽的影响Table 1 Effect of drying method on gel color of egg white powder

注：同列肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2.3 干燥处理后鸡蛋清蛋白的结构与理化性质分析

2.3.1 巯基含量及表面疏水性分析

蛋白质变性程度及聚集度是影响蛋清蛋白凝胶性的主要因素；蛋白质的疏水性是配位体间非共价键相互作用的结果，影响其稳定性、构象及凝胶性[18]，并且与疏水基团暴露的程度有关。研究表明溴酚蓝可与蛋白质分子表面的疏水性结合位点结合，因此可以作为蛋白质表面疏水性的指标[14]。

图2 干燥方式对鸡蛋清粉巯基含量及表面疏水性的影响Fig.2 Analysis of total thiol, surface sulfhydryl content and surface hydrophobicity of egg white powder after drying

由图2可知，3种干燥方式均对蛋清蛋白表面疏水性有不同程度的影响，SD、HD与FD的表面巯基含量分别为5.33%、4.50%和3.71%，差异显著(P<0.05)，且与凝胶硬度成正比。这可能与蛋清中含量最高的卵白蛋白变性有关；其含有4种自由疏水基团但常包埋于分子内部[19]，而热处理破坏了卵白蛋白的空间结构使疏水基团暴露，干燥温度越高暴露程度越大，因此，SD蛋粉的表面巯基含量比HD更大。SD和HD(44.25%和45.00%)比FD(47.63%)蛋清粉总巯基的含量降低了3.38%、2.63%(P<0.05)。3种样品的表面巯基含量为SD>HD>FD，而其总巯基含量为SDSD(63.65%)>HD(58.79%)(P<0.05)。SD与HD蛋清粉的表面疏水性比FD分别降低了2.04%、6.9%；其原因可能是干燥过程温度升高导致蛋白质与葡萄糖发生美拉德反应，引入亲属基团所致[6]。迟玉杰等[22]发现蛋清经糖基化处理后，其凝胶硬度提高，因此，SD与HD的凝胶硬度比FD的更大。

2.3.2 FT-IR分析

蛋白质的凝胶特性不仅与加工方法和疏水基有关，还与蛋白质的结构特性密切相关，FT-IR可分析蛋白质分子间和分子内部氢键以及N—H、O—H键的伸缩振动强度等变化规律。

图3 干燥后鸡蛋清粉红外光谱图Fig.3 Analysis of fourier transform infrared spectrometer of egg white powder after drying

表2 鸡蛋清粉酰胺I带二级结构组成比例单位：%

Table 2 Egg powder amide I band secondary structure composition ratio

2.3.3 DSC分析

DSC常用于蛋白质热变性过程的热力学研究。蛋白质受热吸收能量，氢键断裂，蛋白质分子展开变为无序结构，即为热变性过程。峰值温度(Tp)代表蛋白质热稳定性与聚集程度。热焓值(ΔH)的大小通常能够反映蛋白质结构的变化，热焓值越小蛋白质结构展开就越彻底。由图4可知，3种干燥蛋清粉均出现了明显的放热峰。3种样品的Tp值顺序为：SD>HD>FD；SD和HD蛋清粉的热变性温度较FD的分别提高了13.9和3.56 ℃。而如表3所示，热焓值顺序为：SD

图4 干燥后鸡蛋清粉的差示扫描量热分析Fig.4 Analysis of differential scanning calorimetry of egg white powder after drying

表3 干燥后鸡蛋清粉的热变性温度及热焓值Table 3 Heat denaturation temperature and enthalpy value of egg white powder after drying

干燥方式峰值温度(Tp)/℃热焓值(ΔH)/(J·g-1)SD110.36±0.05128.88±0.4HD100.02±0.01149.46±0.8FD96.46±0.02174.95±0.5

上述结果与KATO等[28]的研究一致，他们发现蛋清焓值的降低，表明蛋白结构展开，同时伴随其凝胶硬度的增加。一方面可能是SD和HD比FD温度高，使样品变性程度大，α-螺旋结构展开，暴露出更多的疏水基团。蛋白质热稳定性与其氨基酸组成成分相关，疏水性氨基酸所占比例越高其热稳定性越好[29]。另一方面可能是较高的干燥温度使蛋白质与蛋清粉中残留的葡萄糖发生美拉德反应,提高了热稳定性[30]。

2.3.4 荧光分析

基于前面对蛋清蛋白热稳定性及疏水性研究的基础上，采用荧光光谱在三级结构上来研究3种样品的蛋白质构象差异。不同干燥方式会引起蛋白质结构发生不同程度的变性，芳香族氨基酸残基的位置及所处微环境也随之发生改变[31]。

图5 干燥后鸡蛋清粉的荧光光谱Fig.5 Analysis of fluorescence spectroscopy of egg white powder after drying

由图5可知，3种样品在340 nm处的吸收峰强度顺序为：FD>SD>HD，但是荧光峰的位置未有明显迁移，随着干燥方式不同对芳香族氨基酸的微环境的影响也不同。荧光强度与表面疏水性呈正相关，SD与HD的荧光强度比FD弱，发生荧光猝灭可能是由于葡萄糖与蛋白质分子的结合对色氨酸有屏蔽作用；而SD的荧光强度大于HD，其原因可能是SD的干燥温度更高使蛋清蛋白变性程度大，色氨酸侧链基团暴露于溶剂中，微环境极性增强，荧光强度增强，文献表明，一定温度范围内，加热温度与蛋白凝胶硬度呈正相关[32]。

2.3.5 扫描电镜(SEM)分析

蛋白质凝胶化是变性蛋白分子在一定程度上聚集形成的连续网络结构。由图6可知，在相同放大倍数下3种样品均可以形成多空有序的结构，类似于“蜂窝”状，此结构赋予了蛋清更好的凝胶性[33]；但样品间孔径大小不同(SD

图6 干燥后鸡蛋清粉凝胶的微观结构分析(×5 000)Fig.6 Analysis of gel microstructure of egg white powder after drying

3 结论

(1)通过对比3种不同蛋清粉样品可知，干燥方式对蛋清粉的凝胶特性、凝胶色泽、表面疏水性、巯基含量、结构等均有显著影响；通过对蛋清粉凝胶特性及色差分析，得出SD、HD较FD得到的蛋清粉凝胶硬度分别提高了49.47%、23.87%。凝胶失水率与凝胶强度成反比，分别为27.4%、30.1%、31.2%。3种蛋粉L*值为：FD>HD>SD；SD和HD的b*显著高于FD(P<0.05)。

(2)通过对蛋清粉蛋白质表面疏水性、巯基含量及结构分析得出，SD和HD与FD蛋清粉相比游离巯基含量分别增加了44.84%、22.28%(P<0.05)。表面疏水性为：FD>SD>HD(P<0.05)。SD、HD蛋清粉的热变性温度较FD的分别提高了13.9、3.56 ℃；热焓值较FD的分别降低了46.07和25.49 J/g；结构分析表明，SD和HD相比于FD均可使蛋清蛋白结构展开，表面巯基暴露，且α-螺旋结构减少，β-转角结构增加，凝胶结构密度增大、孔洞减小。但SD的作用效果更加明显，因此可以更有效地改善蛋清粉蛋白的凝胶性质。