宁夏地区牛病毒性腹泻流行情况调研报告

文/郭启勇 魏学峰 柳国锁 黄海碧 吴心华＊

〔1宁夏大学农学院；2 金宇保灵生物药品有限公司（国家工程实验室）〕

牛病毒性腹泻/黏膜病（Bovine Viral Diarrhea/Mucosal Disease，BVD）是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV）引起的一种传染病。BVDV属黄病毒科、瘟病毒属[1]。BVD病程复杂，临床和亚临床症状多样，主要表现在呼吸系统、生殖系统、消化系统，导致免疫抑制[2]。BVDV主要感染牛、绵羊、山羊、鹿等动物，多数表现为隐性感染。新生犊牛经常因为腹泻而死亡[3]。1999年，高双娣等对西北地区BVD做了流行病学调查研究，结果显示，宁夏地区BVD血清学抗体阳性率55.95%[4]。2014年，李智勇等应用ELLSA试验对来自内蒙古部分地区17 个大、中、小奶牛场的2 391 份牛血清样品进行了BVDV抗体检测，结果显示，阳性率最高达100.00%，最低46.80%，平均88.90%[5]。2015年，姚伟对辽宁省部分地区的739 份血清中的BVDV抗体水平进行了调查，结果显示，平均阳性率为74.00%[6]。2015年，王晓亮等对宁夏地区BVD流行情况进行调查，BVD血清学抗体阳性率高达64.92%[7]。2016年，何小丽等对宁夏地区疑似BVD的奶牛采取了135 份耳组织，进行BVDV抗原检测，阳性率最高0.50%，平均0.01%[8]。

表1 BVDV引物序列

表2 宁夏地区BVDV抗体检测结果

1 材料与方法

1.1 材料

BVDV抗体试剂盒购自美国IDEXX公司。采集宁夏地区牧场的牛血样1 500 份进行抗体检测，295份肛拭子进行抗原检测。

1.2 仪器

生物安全柜、高速冷冻离心机、组织破碎匀浆仪、荧光定量聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）仪和酶标仪。

1.3 BVDV 抗体检测

按照爱德士公司BVDV抗体检测说明书进行操作。北京爱德士元亨生物科技有限公司提供免费的数据分析软件（xChek），计算平均值、S/P比值以及提供综合信息。试验结果的有效性判定，NCx≤0.25，S/P＜0.20为阴性；0.2≤S/P＜0.30为可疑；S/P≥0.30为阳性。

1.4 BVDV 抗原检测

在生物安全柜内处理。取大约5 mg的组织病料放置于2 mL带有钢珠的离心管中，用剪子尽可能剪碎，再用高通量组织研磨仪研磨、裂解组织。加入磷酸缓冲盐溶液（Phosphate Buffer Saline，PBS）进行稀释，取1 mL稀释液放入2 mL离心管中，编号，置于-20 ℃冰箱中保存备用。肛拭子在超净工作台中加入定量的PBS，漩涡振荡后，吸取1 mL液体到2 mL离心管中，编号，置于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.4.1 病料总RNA提取

采用TaKaRaMinBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒提取病料组织的总RNA。

1.4.2 PCR扩增

根据GenBank中的BVDV基因序列，利用DNAStar软件MegAlign模板分析选择Ⅰ型的5，UTR保守序列，引物由北京华大基因工程公司合成，探针由宝生物工程（大连）有限公司合成，见表1。

1.4.3 扩增体系

one step RT-PCR buffer III 12.5 μL，ExTaq HS 0.5 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.5 μL，上、下游引物（20 μmol/L）各1.0 μL，I型1.0 μL，模板核酸2 μL，加无酶水补充至25 μL。扩增条件为：反转录51 ℃，15 min；94 ℃，2 min；PCR反应94 ℃，30 s；52 ℃，30 s，45 个循环，扩增曲线呈现典型的“S”型曲线。

结果判定标准，若被检样品出现“S”型扩增曲线，且CT值为10～35，则结果为阳性；若35＜CT值≤37，则结果为可疑，即样品需要复检；若CT值＞37，则判定为阴性。

表3 宁夏不同地区BVD抗原检测结果

2 结果

（1）BVDV抗体检测

检测结果见表2。结果显示，宁夏地区BVDV抗体阳性率，最高为93.42%，平均值为87.60%。

（2）BVDV抗原检测结果

检测结果见表3。结果显示，阳性率最高为3.57%，平均阳性率为2.71%。

3 讨论

宁夏是我国奶牛集约化养殖水平较高的省份之一。随着牛场的不断扩繁、扩群，BVDV的传播也随之增加，该病主要导致奶牛产奶量下降，对整个地区的奶牛养殖业造成极大的威胁。本次试验共检测牛血清1 500 份，其中BVDV血清学阳性的牛有1 314 头，抗体阳性率高达87.60%。抗原检测295 份肛拭子，阳性个数为8 份，阳性率为2.71%。

BVD是全球范围内流行广泛的一种传染病，宿主比较广泛，主要是牛，也可以感染一些野生动物。该病毒与猪瘟具有血清学交叉反应性，也可以感染猪，给养猪业造成严重的经济损失[9]。BVDV主要通过乳产品、公牛精液、胎盘传播[10]。BVDV持续感染（Persistently Infected，PI）牛可不断地向环境中排毒，导致牛场永久性污染。该病的免疫抑制和持续性感染是本病长期存在于牛场而难以清除的主要原因，目前国际上主要是通过疫苗免疫来防止本病的发生与恶化。

BVDV在宁夏地区流行的主要原因：第一，宁夏地区一直有BVDV牛场的存在，一些牛场甚至存在PI牛，但并没有被养殖场（户）所重视；第二，宁夏地区不断从国外引进荷斯坦奶牛、西门塔尔肉牛、安格斯肉牛的胚胎和精液，其中可能携带BVDV；第三，宁夏地区处于甘肃、内蒙古、新疆等养牛大省的交界地带，牛只调运频繁，加快了本病的传播；第四，相关从业人员携带病毒，牛场的防疫措施不够完善，技术服务团队在各个牛场服务时导致BVDV传播。