GTSF1在肝癌组织中的表达及其对肝癌细胞生物学特性的影响

米凯 黄锐（通讯作者）

（1 核工业四一六医院＜成都医学院第二附属医院＞普外科 四川 成都 610501）

（2 四川省医学科学院·四川省人民医院 四川 成都 610072）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一种致死率较高的恶性肿瘤，发病率一直居高不下，严重危害人类的生活健康。仅有少数肝癌患者被明确诊断时具有手术的机会，且术后存活期短，多数肝癌患者通常预后较差，并伴有高转移风险、易复发等[1]。目前，寻找新的治疗靶标及有效治疗手段迫在眉睫，且在分子水平了解肝癌发病机制，对发现潜在的诊断和治疗靶点，从而对肝癌的早期诊断和治疗提供实验基础具有重要意义。配子体特异性因子1（GTSF1）基因参与生殖细胞中的DNA甲基化和反转录转座子活化，特别是在细胞增殖期间[2]。本文旨在评估肝癌组织中GTSF1基因表达的水平，以及其在人肝癌细胞系中的作用，为肝癌发生的分子病因及肝癌诊断和治疗提供方向。

1.资料与方法

1.1 对象

选择2016年1月－2018年12月四川省医院4例术后肝癌组织标本及其癌旁组织（距离肝癌组织5cm以上）标本。均签署知情同意书，经四川省医院伦理委员会批准。

1.2 实时荧光定量PCR检测

采用RNA提取试剂盒（Invitrogen）提取结肝癌组织、癌旁组织总RNA，测定A260和A280吸光度值，电泳确定RNA的完整性后，依据mRNA反转录试剂盒说明，合成cDNA，用PCR仪扩增，实验结果在荧光定量操作系统中进行分析对比，采用2-ΔΔCt对GTSF1 mRNA表达进行相对定量。

1.3 细胞培养及转染

HepG2肝癌细胞（南京凯基生物）在含10%胎牛血清、含1%双抗（青霉素和链霉素）的DMEM高糖培养基中，置于温度37℃、含5%CO2培养箱培养，取对数生长期细胞，根据所转染的siRNA的不同分成对照组、NC-siRNA组和GTSF1 siRNA组，分别转染GTSF1的siRNA，NC的siRNA，37℃孵育48h后收集所有细胞。

1.4 CCK-8法检测细胞增殖能力

取收集的细胞，按照CCK-8检测试剂盒（北京索莱宝生物）说明检测，将各实验组细胞按每孔3×103个细胞接种于96孔板，加入100μL完全培养液于37℃、含5%CO2培养箱，培养48h后，每孔加入10μL CCK-8，继续培养4h后用酶标仪检测各组细胞在450nm处的吸光度值（A），细胞增殖活力（%）=（A实验组-A对照组）/A对照组×100%。

1.5 流式细胞技术检测细胞凋亡

取收集的细胞，按Annexin V-PI说明书（北京索莱宝生物）检测，各实验组细胞以5×105/mL的密度接种于6孔板中，培养48h后取出6孔板，用PBS清洗细胞表面残留的培养液，常规重悬后加入AnnexinV APC、7-AAD，轻轻摇动，使其混合均匀，室温避光孵育15min，上流式细胞仪（美国BD）检测，总凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.6 统计学方法

数据采用SPSS20.0统计软件进行统计学分析，计数资料采用率（%）表示，进行χ2检验，计量资料采用（±s）表示，进行t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2.结果

2.1 GTSF1表达水平

RT-PCR结果显示，癌旁组织中GTSF1 mRNA表达显著低于肝癌组织（P＜0.05），见图1。

图1 GTSF1 mRNA表达

2.2 细胞增殖、凋亡比较

细胞增殖结果显示GTSF1 siRNA组细胞增殖显著低于NC-siRNA组及对照组（P＜0.05），细胞凋亡结果显示GTSF1 siRNA组细胞凋亡显著高于NC-siRNA组及对照组（P＜0.05），见表、图2。

表 不同处理组细胞增殖、凋亡比较

图2 细胞凋亡

3.讨论

肝癌（HCC）与肺癌、胰腺癌一起被称为病死率最高的三大癌症。我国是肝癌高发大国，世界上将近一半的新发肝癌患者在中国，且发病率近年居高不下，而HCC的发生是一个复杂多步骤过程，涉及调节基因中遗传和表观遗传改变的积累。癌症相关分子的鉴定可能导致治疗的新分子靶标和预测预后的生物标志物的发展。因此，多种遗传和表观遗传因素可能影响HCC的发展[3]。已有研究报道，GTSF1基因参与生殖细胞中的DNA甲基化和反转录转座子激活，特别是在细胞增殖中，并且它存在于MF肿瘤样品中，表明它可能在MF的细胞凋亡抗性中发挥作用[4]。同时，GTSF1基因可以在各种生理过程中起到增殖因子的作用[5]。就肝癌而言，已有许多关于与肝癌发展相关的分子标志物的研究，并且已经通过肿瘤组织的基因表达谱确定了具有诊断和预后潜力的基因标记[6]。本结果中，确定肝癌组织样品中GTSF1 mRNA表达较其在相邻的非肿瘤肝组织中表达明显增加（P＜0.05），提示GTSF1可能参与肝癌发生，其表达水平可能是肝癌诊断的潜在生物标志物。

在肿瘤发展期间，肿瘤标志物的数量、类型、分布和表达水平与肿瘤密切相关，然而，尚缺乏理想的肿瘤标志物用于肝癌的诊断和预后的评价[7]。研究表明GTSF1在肝细胞瘤细胞系中经常上调，且GTSF1可在体外增加集落形成，证明GTSF1促进体内肿瘤生长。所有这些数据都强调了GTSF1在肿瘤发生中的基本作用，特别是在肝癌的发展中。因此，GTSF1表达可能在体内HCC肿瘤细胞的增殖中起关键作用[2]。为了探索GTSF1的作用，采用siRNA转染肿瘤HepG2细胞，观察GTSF1基因对细胞增殖及凋亡的影响，结果显示GTSF1 siRNA组细胞增殖显著低于NC-siRNA组及对照组（P＜0.01），GTSF1 siRNA组细胞凋亡显著高于NC-siRNA组及对照组（P＜0.05）。表明GTSF1的过表达参与调节肝癌细胞增殖、增加致癌性。

综上所述，GTSF1基因在肝癌发生的分子病因学中具有重要作用，提示GTSF1 mRNA表达在肝癌诊断和治疗中的潜在应用。由于所涉及的病例数量相关的限制，并且患者均来自本研究中的单个区域，GTSF1 mRNA和蛋白质表达在肝癌中的功能还需进一步观察。