RP-UPLC法测定黄芪提取物中的黄酮类成分

徐波 牛涛 陈红 张学敏

（天津天士力现代中药资源有限公司 天津 300410）

芪参益气滴丸主要用于治疗心肌损伤、心功能减退、心肌梗死等疾病。处方中含有四味中药，分别为黄芪：补元气，使气旺以促血行，祛疲而不伤正，气旺以促津行，具有帅诸药之力；丹参及三七：活血祛疲，通络止痛，共为臣药；降香：气香辛散、温通行滞；四味药合用具有益气活血、通络止痛之功效[1]。

黄芪提取物为芪参益气滴丸的制剂中间体，主要含有黄酮类和皂甙类等成分[1]。其中黄酮类成分主要为异黄酮，研究表明异黄酮对人体生理代谢有益的调节功能[2]。本论文建立了黄芪中四种主要异黄酮成分的含量测定方法，并进行了方法验证。

1.实验用品

1.1 仪器

Acquity UPLC超高效液相色谱仪，紫外检测器，Empower3化学工作站（美国Waters公司)；AG104电子天平（瑞士METTLER 公司）；Milli-Q超纯水处理系统（美国MILLIPORE公司）。

1.2 试药

毛蕊异黄酮葡萄糖苷(111920-201501)、芒柄花素(111703-201202）对照品购自中国食品药品检定研究院；毛蕊异黄酮、芒柄花苷对照品购自天津一方科技有限公司(归一化法测定，含量≥98%)。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。黄芪提取物由天士力现代中药资源有限公司提供。

2.方法与结果

2.1 色谱条件

采用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱，以0.2%甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱程序，流速为0.4mL/min；检测波长：254nm，见表1。

表1 流动相梯度洗脱条件

图1 标准品图谱（a）和黄芪提取物图谱（b）

2.2 标准品溶液的制备

分别取毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷标准品适量，加甲醇配制成每毫升含毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷分别为0.01mg、0.04mg、0.004mg和0.15mg的溶液。取2ul,注入液相色谱仪，记录峰面积。

2.3 样品溶液的制备

取黄芪提取物约0.2克，精密称定，加70%甲醇溶液适量，超声溶解，加70%甲醇至25毫升，摇匀，取2ul,注入液相色谱仪，记录峰面积。外标法计算含量。

3.方法学验证

3.1 线性关系考察

精密称取毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷对照品适量，加甲醇配制成每毫升含毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷分别为0.1mg、0.4mg、0.04mg和1.5mg的混合对照溶液，再分别取量取0.5、1、2、4、5、10ml混合对照溶液置于50ml量瓶中，加水至刻度，混匀，制成系列溶液，注入液相色谱仪，测定，以对照品浓度(mg·L-1)为横坐标(X),相应的峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线,建立回归方程，见表2。

表2 回归方程、相关系数及线性范围

3.2 进样精密度试验

取上述供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件重复进样6次，记录毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷的峰面积，峰面积的RSD分别为0.27%、0.16%、0.39%和0.70%，结果表明进样精密度良好。

3.3 稳定性试验

取供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24h进样，记录毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷的峰面积，峰面积的RSD分别为1.19%、0.29%、2.13%和1.18%，结果显示供试品溶液在24h内稳定。

3.4 重复性试验

精密称取黄芪提取物6份，按“2.3”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷的平均含量分别为0.037%、0.216%、0.021%和0.953%，RSD分别为0.90%、1.02%、0.36%和0.93%，结果表明方法重复性良好。

3.5 加样回收率试验

精密称取已知含量的黄芪提取物6份，每份约0.25g，分别精密加入混合对照品溶液 (每毫升含毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷和芒柄花素分别约为0.02mg、0.11 mg 、0.45mg和0.01mg) 5ml，自“加70%甲醇溶液适量，超声溶解”起，按“2.3”项下方法操作，取2ul注入色谱仪，分别计算毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷和芒柄花素的回收率，见表3。

表3 回收率实验结果（%，n=6）

3.6 样品的测定

取不同批次的黄芪提取物，按“2.3”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以外标法计算4种黄酮成分的含量，结果见表4。

表4 样品测定结果（n=6）

4.讨论

4.1 采用超高效液相色谱法进样，能够在8分钟内完成四种黄酮类成分的有效分离，有效提高了分析效率。

4.2 应用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱，本色谱柱的碳链键合密度低，使分析物能更容易进入颗粒材料的孔结构中，为极性和疏水性分子提供均衡的保留性能而，能够使单一色谱方法用于分析多种不同极性的成分，且无需使用离子对试剂。而黄芪提取物中的黄酮成分极性差别很大，使用HSS T3色谱柱保证了各成分的色谱分离度。

4.3 分别以0.1%、0.2%、0.5%甲酸水溶液为流动相A进样测定，色谱图显示，0.1%甲酸水溶液为流动相A时，黄酮成分的色谱峰峰形较差，分离度偏低，0.2%、0.5%甲酸水溶液为流动相A的色谱峰峰形及分离度较好，考虑试验条件的温和性，采用0.2%甲酸水溶液为流动相A。