长江口表层沉积物中合成聚酯降解菌的多样性研究❋

刘 欣， Patrick HILLE， 郑明刚， 高 萍， 尚 琨， 韦 韧， 刘同军， 曲凌云

(1.齐鲁工业大学，山东 济南 250353； 2．自然资源部第一海洋研究所，山东 青岛 266061； 3．莱比锡大学，德国 Leipzig 04103； 4. 大连海洋大学水产与生命学院，辽宁 大连116023)

海岸带及海洋环境中的塑料污染已经成为全球环境问题。Jenna R. Jambeck等[1]估算出2010年全球192个沿海国家和地区共产生塑料垃圾2.75亿t，其中有4.8～12.7万t通过不同的途径流入海洋，而这个数量还在持续增加。预计至2025年，全球海洋中塑料垃圾量将高达2.5亿t，其中绝大部分塑料难于或无法被降解而长期存在于环境中。海洋环境中的塑料一方面通过误食、缠绕等方式对浮游动物和底栖生物产生危害；另一方面通过表面富集金属物质、持久性有机污染物(POPs)，如多氯联苯(PCBs)、多环芳香烃(PAHs)、滴滴涕(DDTs)以及其他有机氯农药，作为污染物载体影响海洋生态系统的健康和持续发展[2-4]。

为解决和减轻塑料污染等一系列环境问题，可生物降解塑料的研究成为一个新的研究热点。聚己内酯(Polycaprolactone，PCL)是一类化学合成的高分子材料，它是以二元醇为反应开始剂，通过ε-己内酯开环聚合生成的产物。由于PCL的熔点较低且具有较好的生物降解性能和生理相容性而被广泛应用，成为一种获得美国FDA批准的完全生物降解材料[5]。三丁酸甘油酯(Tributyrin)天然存在于牛脂中，工业应用主要是人造黄油的加工和作为饲料添加剂。在生物科技中作为筛选、表征酯酶的底物。除此之外，Tributyrin还可以被添加在聚羟基丁酸酯(Polyhydroxybutyrate, PHB)中起到增塑剂作用，并可以改变PHB的可生物降解性[6]。但目前，国内外关于生物降解塑料的研究大多侧重于材料的改性以提高降解效果而较少从微生物角度进行塑料降解的研究。

PCL、Tributyrin等在自然界的生物降解主要由微生物参与[8]。人们对PCL生物降解的认识起源于1970年代，Tokiwa Y等分离得到第一株可降解ε-PCL的微生物，经鉴定为Penicilliumsp.[8]。2011年，Sekiguchi T等在深层海洋中分离出5株耐低温、耐高压的PCL降解菌株，分别为Alcanivorax(1株)，Tenacibaculum(1株)，Pseudomonas(3株)[9]。2012年，Li等[10]从土壤中筛选出 1 株 PCL 降解菌PenicilliumoxalicumDSYD05-1，且对 PCL有着较高的降解效率。有研究报道称已从土壤中筛选出 1 株以PCL为唯一碳源的嗜热菌株Streptomycesthermoviolaceussubsp．76T-2，该菌株在 45 ℃环境下培养6 h，可将培养基中的 PCL 完全降解[11]。从不同自然环境筛选可降解PCL、Tributyrin等材料的菌株，有助于研究微生物降解不同酯类底物的特性和规律，也可为类比评估其他聚酯类可生物降解塑料的应用和污染防控提供参考。

河流入海口是陆地和海洋相互作用的交界地区，也是人类活动产生的大量塑料垃圾输送入海的必经之地[12]，但目前对这一生境中塑料降解菌的研究极少。本研究以中国长江入海口临近海域表层沉积物中的微生物为研究对象，筛选具有降解PCL和Tributyrin活性的菌株，并评估其多样性，为揭示海洋沉积物中塑料垃圾的微生物降解机制、开发利用海洋中塑料解聚酶等提供菌株资源。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 样品 实验所用菌种为2017年2、5、7、9月从长江口27个站位表层沉积物中分离获得，保藏于本实验室。

1.1.2 培养基

(1)2216E 培养基(g/L) 酵母提取物 5 g、胰蛋白胨10 g、琼脂20 g、陈海水，PH调至7.6～7.8，121 ℃高压灭菌20 min。

(2)PCL固体培养基(g/L) 酵母提取物 5 g、胰蛋白胨10 g、琼脂20 g、PCL 0.5 g、丙酮100 mL、陈海水 1 L。PCL用丙酮于50℃溶解，每0.5 g PCL加入丙酮100 mL。除PCL溶液外，其余试剂加入培养基，0.1 MPa灭菌20 min后用磁力搅拌器搅拌，同时加入溶解好的PCL。

(3)增塑剂固体培养基(g/L) Tributyrin(增塑剂) 10 mL、酵母提取物 5 g、胰蛋白胨10 g、琼脂20 g、陈海水1 L。除Tributyrin外，其余试剂加入培养基，0.1 MPa 灭菌20 min；待培养基灭菌后冷却至70 ℃左右加入Tributyrin，每100 mL 培养基加入Tributyrin 1 mL。剧烈震荡并于70 ℃超声5 min。

1.2 方法

1.2.1 酯类降解菌降解活性的测定 将筛选出的可降解PCL和Tributyrin的菌株分别接种于含PCL和Tributyrin的固体培养基上，30 ℃培养4～5 d，肉眼观察，测量透明圈直径和菌落直径。

1.2.2 16S rRNA 基因的扩增与序列分析

(1)16SrRNA 基因模板的制备 用灭菌的枪头挑取单菌落于38 μL 无菌水中混匀。置于PCR 仪，99 ℃ 20 min。

(2) PCR 扩增所用引物 27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，1492rrrr(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR 反应体系(60 μL)：Premix TaqTM30 μL，引物各3 μL，模板菌3 μL，无菌水补足至60 μL。PCR 反应条件：95℃ 5 min；94℃45 s，60 ℃45 s，72 ℃90 s，35 个循环；72 ℃ 10 min。PCR 产物送至上海生工生物科技有限公司测序。

(3) 将所测菌株的16SrRNA 基因序列通过EzBioCloud 数据库(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)进行比对。一般认为，16S rRNA 基因序列相似性大于98.65%，可以认为是同1个种，同源性小于98%可以认为是不同的种，小于95%可以认为是不同的属。并将获得的16S rRNA 基因序列提交到NCBI 进行序列号的注册。

1.2.3 系统发育学分析 通过MEGA 7.0及邻接法(Neighbor-Joining)对相似度最高的基因序列建立系统发育树，通过自展分析(Boot strapping)进行系统发育树的评估，自展数据集为1 000 次。

1.2.4 多样性分析 以种为分类水平，分别计算不同类型合成聚酯及不同采样时间的合成聚酯降解微生物的Shannon指数和Simpson指数：

Shannon-Wiener 多样性指数[17]计算公式：

H=-∑(Pi)(log2Pi)，Pi=ni/N。

Simpson 相遇指数计算公式：

D=1-∑(ni/N)2。

式中，ni=群落中第i个种的个体数量。

2 结果与分析

2.1 PCL、Tributyrin降解菌株的数量分布

从长江口表层沉积物4个月份样品中获得合成聚酯降解菌480株，其中仅降解Tributyrin 34株，占比7.08%；仅降解PCL 1株；能同时降解PCL和Tributyrin 445株，占比92.71%。

2.2 PCL、Tributyrin降解细菌的16S rRNA 基因序列分析

将菌株的 16S rRNA 基因序列进行EzBioCloud比对分析，根据同源性比对结果确定所获得的合成聚酯降解细菌分属于14个属50种，不同种合成聚酯降解菌代表菌株序列比对结果见表1～3。

2.3 PCL、Tributyrin降解菌降解能力的测定

降解PCL和Tributyrin的菌株在PCL、Tributyrin固体培养基上形成的透明圈直径(D)与菌落生长直径(d)的比值(D/d)是评估PCL和Tributyrin降解能力的指标之一，可初步判别菌株降解PCL和Tributyrin的能力。本实验选取直径比(D/d)大于 1.5 的菌株作为降解能力较好的菌株。PCL和Tributyrin降解菌在平板上的降解现象见图2，所获得的降解能力较好的菌株列于表4、5。由结果可知，有131株Tributyrin降解菌株形成的透明圈直径(D)与菌落生长直径(d)的比值均大于1.5，其中从2、5、7、9月获得的菌株数分别为43、16、25、47株；有29株PCL降解菌株形成的透明圈直径(D)与菌落生长直径(d)的比值均大于1.5，其中从2、5、7、9月获得的菌株数分别为7、10、3、9株。

(T:三丁酸甘油醋降解菌 Tributyrin；P：聚己内醋降解菌 PCL degrading bacteria)

图1 长江口沉积物四个月份不同类型 合成聚酯降解菌数量比例图
Fig.1 Proportions of polyester degrading bacteria for degrading different substrates from sediments in the Yangtze River Estuary isolated in four months

表1 只降解Tributyrin菌株16S rRNA 基因序列比对结果Table 1 The 16S rRNA gene comparison results of tributyrin degradingbacteria

表2 同时降解PCL、Tributyrin菌株16S rRNA 基因序列比对结果Table 2 The 16S rRNA gene comparison results of bacteria able to degrade both PCL and tributyrin

表3 只降解PCL菌株16S rRNA 基因序列比对结果Table 3 The 16S rRNA gene comparison results of PCL degrading bacteria

2月Tributyrin降解菌有10种菌直径比大于1.5，5种属于Psychrobacter、3种属于Bacillus，另外两种分别属于Brevibacterium和Pseudoalteromonas； PCL降解菌有3种菌直径比大于1.5，2种属于Psychrobacter，另外一种属于Bacillus；5月Tributyrin降解菌有8种菌直径比大于1.5，5种属于Bacillus，另外3种分别属于Exiguobacterium、Fictibacillus、Vibrio属； PCL降解菌有8种菌直径比大于1.5，7种属于Bacillus，另外一种属于Vibrio；7月份有6种菌直径比大于1.5，6种都属于Vibrio； PCL降解菌有1种菌直径比大于1.5，属于Vibrio；9月份Tributyrin降解菌有9种菌直径比大于1.5，6种属于Vibrio，2种属于Exiguobacterium，另一种属于Glechoma； PCL降解菌有3种菌直径比大于1.5，2种属于Vibrio；另一种属于Exiguobacterium。所获得降解菌株中降解能力较好的菌株主要集中在Psychrobacter、Bacillus和Vibro属。这些菌株降解效果优于其他菌株，可为下一步的研究提供优质菌种资源。

(T:三丁酸甘油醋降解菌 Tributyrin；P：聚己内醋降解菌 PCL degrading bacteria)

图2 PCL和Tributyrin固体培养基上产生的透明圈
Fig.2 Clear lysis zones on PCL and tributyrinplates

表4 直径比(D/d)比大于1.5的Tributyrin降解菌Table 4 Tributyrin degrading bacteria with a ratio between the clear zone diameter (D) and the colony diameter (d) of greater than 1.5

续表4

代表菌株编号No.分离月份Separationmonth相似菌株Similar straing相似度Similarity /%菌株数Number of bacteria 直径比Diameterratio201705CJKOP-105Bacillus megaterium NBRC 15308(T)99.7211.600201705CJKOP-115Vibrio hyugaensis 090810a(T)100.0041.556201705CJKOP-94Fictibacillus halophilus AS8(T)99.5811.500201707CJKOP-Y1777月Vibrio fluvialis NBRC 103150(T)99.3832.400201707CJKOP-57Vibrio alginolyticus NBRC 15630(T)99.2811.800201707CJKOP-Y27Vibrio furnissii CIP 102972(T)99.4541.600201707CJKOP-Y45Vibrio atypicus HHS02(T)99.2911.583201707CJKOP-Y1Vibrio neocaledonicus NC470(T)99.43152.670201707CJKOP-Y150Vibrio antiquarius Ex25(T)99.2411.500201709CJKOP-229月Glechoma hederacea98.2112.222201709CJKOP-5Exiguobacterium profundum 10C(T)99.1821.900201709CJKOP-57Vibrio neocaledonicus NC470(T)99.86311.800201709CJKOP-33Vibrio coralliilyticus ATCC BAA-450(T)97.1831.800201709CJKOP-9Vibrio hyugaensis 090810a(T)99.3521.667201709CJKOP-64Vibrio crassostreae LGP7(T)99.6631.583201709CJKOP-51Vibrio antiquarius Ex25(T)99.3111.500201709CJKYOP-55Vibrio campbellii CAIM 519(T)99.0021.500201709CJKOP-64Exiguobacterium mexicanum 8N(T)98.3721.500

表5 直径比(D/d)大于1.5的PCL降解菌Table 5 PCL degrading bacteria with a ratio (D/d) between the clear zonediameter (D) and the colony diameter (d) of greater than 1.5

2.4 多样性分析

以种为分类地位计算不同类型材料及不同采样时间的合成聚酯降解微生物的Shannon指数和Simpson指数(见表7)，结果表明长江口邻近海域27个站位的表层沉积物在2、5月份合成聚酯降解微生物的种类更丰富；Tributyrin降解菌的物种丰富度高于PCL降解菌的物种丰富度。

表6 不同季节可培养降解合成聚酯细菌生物多样性Table 6 The diversity of culturable polyester degradingbacteria in different season

表7 降解不同合成聚酯的可培养细菌生物多样性Table 7 The diversity of culturable polyester degrading bacteria

2.5 系统发育分析

通过扩增获得的 16S rRNA 基因序列在EzBioCloud 进行序列比对，将只能降解Tributyrin和可同时降解PCL和 Tributyrin的细菌分别构建系统发育树(见图3、4)。由结果可知，18种只降解Tributyrin和31种同时降解PCL和Tributyrin的细菌均聚类于Firmicutes、Proteobacteria。

(自展数据集为1 000次。括号内为GenBank 登录号；分支上的数字为自展值百分比；线段0.05 为核苷酸替换率。The bootstrap data set is 1 000 times. Numbers in parentheses represent the sequences’ accession number in GenBank; The number at each branch point is the percentagesupported by bootstrap; Bar: 0.05 substitutions per nucleotide position.)

图3 根据 16S rRNA 基因序列构建的18 种只降解Tributyrin细菌的系统发育树
Fig.3 NJ phylogenetic tree of 18 onlydegrading Tributyrin bacteria based on 16S rRNA gene sequences

2.6 PCL、Tributyrin降解菌的种群分布

图5显示2017年长江口表层沉积物中4个月份PCL和Tributyrin降解菌各属细菌数量。4个月份样品获得的PCL和Tributyrin降解菌分属于14个不同的属：其中只能降解Tributyrin的34株菌分属于Psychrobacter、Bacillus、Exiguobacterium、Fictibacillus、Oceanobacillus、Paenibacillusr、Vibrio、Brevibacterium、Chromohalobacter、Staphylococcus10个不同的属，优势属为Vibrio；只降解PCL的1株菌分属于Kocuria。能同时降解PCL和Tributyrin的445株菌分属于Psychrobacter、Bacillus、Brevibacterium、Pseudoalteromonas、Vibrio、Staphylococcus、Photobacterium、Glechoma、Exiguobacterium8个不同的属，优势属为Vibrio；Psychrobacter次之。4个月份降解PCL和Tributyrin的菌种，大部分集中于Psychrobacter、Vibrio两个属，且Vibrio为优势属。

(自展数据集为1 000次。括号内为GenBank 登录号；分支上的数字为自展值百分比；线段0.05 为核苷酸替换率。The bootstrap data set is 1 000 times. Numbers in parentheses represent the sequences’ accession number in GenBank; The number at each branch point is the percentage supported by bootstrap; Bar: 0.05 substitutions per nucleotide position.)

图4 根据 16S rRNA 基因序列构建的31种同时降解PCL和Tributyrin细菌的系统发育树
Fig. 4 NJ phylogenetic tree of 31 degrading PCL and Tributyrin bacteria based on 16S rRNA gene sequences

(T:三丁酸甘油醋降解菌 Tributyrin；P：聚己内醋降解菌 PCL degrading bacteria)

图5 长江口沉积物四个月份各属降解合成聚酯细菌数量对比图
Fig.5 The amount of polyester degrading bacterial strains, isolated in different months from sediments in the Yangtze River Estuary, and their genus affiliations

图6显示2017年长江口表层沉积物不同时间PCL和Tributyrin降解菌株各属细菌数量。其中，2月仅能降解Tributyrin的菌株包括Psychrobacter、Bacillus、Exiguobacterium、Fictibacillus4个不同的属，优势属为Psychrobacter；能同时降解PCL和Tributyrin的菌株包括Psychrobacter、Bacillus、Brevibacterium、Pseudoalteromonas4个不同的属，优势属为Psychrobacter。5月仅能降解Tributyrin的菌株包括Oceanobacillus、Bacillus、Brevibacterium、Exiguobacterium、Fictibacillus、Paenibacillus、Psychrobacter、Vibrio8个不同的属，优势属为Bacillus；仅能降解PCL为Kocuria一个属；能同时降解PCL和Tributyrin的菌株包括Bacillus、Vibrio2个不同的属。7月仅能降解Tributyrin的菌株包括Chromohalobacter、Vibrio2个不同的属，优势属为Vibrio；能同时降解PCL和Tributyrin的菌株包括Vibrio、Staphylococcus、Photobacterium3个不同的属，优势属为Vibrio。9月仅能降解Tributyrin的菌株包括Vibrio、Exiguobacterium、Staphylococcus3个不同的属，优势属为Vibrio，6株;能同时降解PCL和Tributyrin的菌株包括Vibrio、Glechoma、Exiguobacterium、Bacillus4个不同的属，优势属为Vibrio。

(T:三丁酸甘油醋降解菌 Tributyrin；P：聚己内醋降解菌 PCL degrading bacteria)

图6 长江口沉积物不同月份各属降解合成聚酯细菌数量对比图
Fig.6 The amount of polyester degrading bacterial strains, isolated in fourmonths from sediments in the Yangtze River Estuary, and their genus affiliations

同一取样时间获得的菌株中，PCL和Tributyrin降解菌种属存在差异，但优势属均相同。不同时间PCL和Tributyrin降解菌的优势属均不相同，2、5、7、9月份的优势属分别为Psychrobacter、Bacillus、Vibrio、Vibrio。不同的生态环境特征是造成细菌群落结构和多样性的最主要原因,长江口海域主要受长江冲淡水和台湾暖流等不同性质水团的共同影响，在不同季节通过自身特征的变化影响微生物群落结构[13]。张东声[14]发现长江口及邻近海域沉积物中细菌具有较高的多样性，主要包括变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、浮霉菌门(Planctomycetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)、和热袍菌门(Thermotogae)。其中，变形菌门(Proteobacteria)为优势类群，占比42.7%；其次为酸杆菌门(Acidobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)，分别占比17.8%和7.2%。其中，冬季和夏季的优势类群均为变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)。由本文分析结果可得PCL和Tributyrin降解菌均聚类于变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)，分别为385、85株。其中，冬季、夏季和秋季的优势类群均为变形菌门(Proteobacteria)。由此表明，变形菌门(Proteobacteria)在长江口沉积物中占据优势地位，同时也是长江口沉积物中降解塑料微生物的重要组成部分。

3 讨论

已见于文献报道具有PCL降解活性的微生物有Bacillus、Pseudoalteromonas、Penicillium、Shewanella、Psychrobacter、Thermophilus等[7-8,10,15]。本研究从海洋环境中分离出多种PCL降解菌株，经鉴定为Brevibacterium、Exiguobacterium、Vibrio、KocuriaStaphylococcus、Photobacterium、Pseudoalteromonas、Psychrobacter。其中，Bacillus[16]、Pseudoalteromonas[9]、Psychrobacter[17]已有前人分离研究过，而Brevibacterium、Exiguobacterium、Vibrio、Kocuria、Staphylococcus、Photobacterium还未有PCL降解活性的相关报道，且其降解透明圈最大直径比(D/d)都在1.5以上，均为具有潜力的PCL降解菌株，这将为海岸带及海洋环境中塑料降解提供新的微生物资源。

微生物在降解PCL时主要是通过分泌胞外PCL水解酶，将高分子降解为小分子然后将小分子单体转运到胞内，再通过其他生化反应将其降解为水、二氧化碳、甲烷、以及其它无毒无害的自然物质[18]。目前，对PCL解聚酶的研究还不多，在PCL降解过程中，可能有两种类型的酯酶。已报道的PCL解聚酶主要属于脂肪酶[19-20]，或者属于角质酶[18]。Tokiwa等[21]在1977年纯化出的PCL降解菌株Penicilliumsp.的胞外酶和OdaY等[19]纯化出的Alcaligenesfaecalisde的胞外解聚酶都被鉴定为脂肪酶。Sonˇa Hermanov[16]等利用枯草芽孢杆菌产生的脂肪酶降解PCL，将该菌株在 30 ℃环境下培养14天，可将培养基中的 PCL 降解10%。本研究筛选出的Bacillus、PsychrobacterPCL降解菌的最大直径比(D/d)依次为3.2、3.25，具有较高的的PCL降解活性，可推断本研究筛选的PCL降解菌是通过分泌某种胞外酶可降解PCL，但其降解特性和降解机制有待进一步探讨。

在PCL降解过程中，会伴随着PCL质量损失、表面形态、结晶度等理化性质的改变。在PCL降解过程中，PCL的晶体结构均受到一定程度的破坏，结晶度都有所降低[22]。Sekiguchi T[9]等在日本浅滩分离出一株降解PCL的假单胞菌，用PCL纤维的强度保持率和纤维的表面形态表征该菌株对PCL的降解能力。经假单胞菌处理1周后，PCL纤维的强度保持率下降到78%，纤维表面变得非常粗糙。因而通过研究降解前后PCL质量损失、表面形态、结晶度等理化性质的改变，有利于推测微生物对PCL的生物降解的效果。本研究下一步将以PCL为碳源，监测PCL降解过程中PCL相关理化性质的改变，另外通过酶学和基因组学研究深入探讨海洋细菌降解塑料的途径和机制。